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給大家?guī)硪黄l(fā)表在《Cancers》(if:6.86)上的文章，腫瘤分子亞型的建立促進了研究人員對腫瘤基因型和表型的認識，在治療和預后評估方面具有潛在的應用價值。這篇干濕結合的文章，利用共識分子聚類方法將肌肉浸潤性膀胱癌（MIBC）劃分為6個分子亞型，系統(tǒng)揭示了6個分子亞型的特異性分化模式、突變基因、組織學和總體生存率。接下來小編帶大家一起閱讀一下這篇文章。
肌肉浸潤性膀胱癌(MIBC)是一種具有相當異質性的惡性腫瘤。MIBC腫瘤微環(huán)境(TME)是高度復雜的，包括不同的表型和空間結構。必須對MIBC TME的復雜性進行描述，以提供精確治療的潛在靶點。本研究采用大細胞計數和成像大細胞計數相結合的方法，對44例MIBC患者的腫瘤細胞、免疫細胞和TME空間特征進行分析。研究人員檢測到異常表型的腫瘤和免疫細胞簇。特別是發(fā)現了一個以前被忽視的癌癥干細胞樣細胞集群(ALDH + PD-L1 + ER -β恖)是與不良預后密切相關。研究人員闡明了在MIBC TME中免疫細胞(排除、浸潤和廢棄)和腫瘤相關膠原(彎曲、拉伸、方向分布和混亂)的不同空間結構。
目前這個研究是第一個在單細胞水平上深入了解MIBC TME復雜性的研究。研究人員的結果將提高對MIBC異質性特征的普遍理解，潛在地促進患者分層和個性化治療。
為了繪制MIBC的TME圖，使用CyTOF(質譜流式細胞儀)評估44例患者的79個樣本(圖S1)，包括44個癌(CA)組織和35個癌旁(CP)組織。采用t-SNE算法對高維數據進行降維，。對MIBC TME中單個細胞的分析顯示了各種獨特的蛋白表達模式(圖1A)。為了檢測TME中的特定聚類，使用表型算法識別了21個表型不同的聚類(圖1B)。CA和CP組織的聚類分析顯示，CA和CP組織中許多聚類的頻率不同，說明CA和CP組織中TME的構成不同(圖1C)。研究人員檢測到7個特異性的CD326和CD45陽性表達，同時具有免疫細胞和腫瘤上皮細胞的特征。這21個特定的聚類顯示出個體樣本之間的高度異質性(圖1E)。在MIBC TME中，腫瘤細胞簇表現出不同的蛋白表達模式(圖1D)。
為了進一步探索特定群集的特征，研究人員根據每個群集的頻率將患者分層，分為高豐度組和低豐度組。值得注意的是，SPADE分析顯示，與低豐度組患者相比，聚10高豐度組患者腫瘤上皮細胞高表達c-Myc、Ki67、vimentin，提示高豐度組患者可能呈現上皮-間充質過渡(epithelial-mesenchymal transition, EMT)狀態(tài)和高增殖率。集群18顯示出與集群10相同的模式(圖2A,B)。
為揭示MIBC生態(tài)系統(tǒng)聚類間的關系，采用spearman秩相關分析。顯示了MIBC TME中集群之間的許多關系(圖2C)。腫瘤干細胞樣細胞簇3、CD326+CD45+腫瘤上皮細胞簇10和18之間存在較強的相關性(圖2D)，表明這些簇在TME中可能發(fā)揮著相似的作用，而腫瘤細胞簇與免疫細胞簇之間存在多種強相關性(圖2C)。上述結果表明，集群間的相互作用導致了MIBC TME的復雜性。
研究人員發(fā)現了一種以前未被欣賞的癌癥干細胞樣細胞集群ALDH + PD-L1 + ER -β恖集群(6)是與不良臨床結果(圖1 d和圖3)。根據聚類6的頻率將患者分為高豐度組和低豐度組，研究人員發(fā)現聚類6高豐度組患者與晚期和年齡相關(圖3B,C)。同時，聚6高豐度組63.6%的患者出現腫瘤脫分化，上皮細胞標志物Pan-CK和E-cadherin表達缺失，而低豐度組只有27.8%的患者出現脫分化狀態(tài)(圖3F,G)。此外，IMC的空間分析顯示，聚類6位于腫瘤侵襲前方的間質區(qū)域(圖3D,E)，代表了腫瘤出芽細胞的表型。
為了進一步了解聚類6中高豐度組和低豐度組患者的分子特征，研究人員分析了這兩組患者之間的差異基因，發(fā)現許多差異基因在神經元胞體中富集，對神經發(fā)生、神經遞質轉運、神經遷移等具有正調控作用。和其他神經相關通路(圖3H)。在TCGA膀胱尿路上皮癌(BLCA)隊列中，高水平的B4GALNT1與臨床分期和不良預后顯著相關(圖4B,C)。在隊列研究中，與B4GALNT1表達顯著相關的基因在神經遞質運輸、神經元分化正調控和許多其他神經相關通路中富集。免疫組化(IHC)染色和蘇木精-伊紅(HE)染色結果顯示，B4GALNT1也位于間質區(qū)，提示B4GALNT1與簇6關系密切。
DEGs富集分析顯示，B4GALNT1高表達組和低表達組成纖維細胞間主要上調的DEGs顯著富集于細胞外間隙、細胞外區(qū)域、ECM和細胞外泌體(圖4D)。此外，通過GO分析高表達組和低表達組腫瘤上皮細胞中上調的deg，發(fā)現細胞外泌體是排在前列的信號通路;細胞外間隙和ECM在前20個信號通路中(圖4E)。高表達組成纖維細胞中HSPH1、HSPD1、HSPA6、HSPA1B、HSPA1A、HSP90AA1等熱休克蛋白表達上調(圖4F)。相關性分析表明,集群的時差B4GALNT1高表達患者顯著高于低表達患者(圖4 g H)和集群的空間分布B4GALNT1高表達患者比低表達患者更混亂,提示B4GALNT1高表達患者的TME中出現更多的細胞-細胞串擾(圖4I,J)。綜上所述，所有這些數據可能表明B4GALNT1通過激活細胞外泌體促進細胞簇間的串擾，從而促進MIBC進展。
近年來，免疫治療是腫瘤治療的革命，它受腫瘤免疫微環(huán)境的影響。為了繪制MIBC的免疫微環(huán)境圖，研究人員設計了一個包含34種抗體的面板來分析MIBC生態(tài)系統(tǒng)中免疫細胞的蛋白表達模式。為了獲得免疫細胞的蛋白表達，研究人員在細胞庫平臺上用免疫細胞特異性標記物CD45對免疫細胞進行門控。然后,通過t-SNE和phenograph算法被用來處理高維數據和識別19免疫細胞集群MIBC生態(tài)系統(tǒng)中不同的表型(圖5),包括6個CD4 + T細胞集群,5 CD8 + T細胞集群、2 B細胞集群,3 DC細胞集群,2巨噬細胞集群,集群NK細胞(圖5)。CA組織和CP組織中群集的頻率差異較大，說明CA組織和CP組織的免疫微環(huán)境是不同的(圖5A,B)。
研究人員進一步分析了單個腫瘤樣本中聚集的頻率，發(fā)現每個樣本中都存在一個數量上具有絕對優(yōu)勢的獨特的免疫細胞簇，表明單個樣本中的免疫細胞是異質性的(圖5D)。T細胞在免疫微環(huán)境中具有抗癌和促癌雙重作用。在MIBC生態(tài)系統(tǒng)中，11個免疫檢查點、共抑制受體和激活標記物表達模式不同的T細胞簇，如圖5C所示，代表耗盡或免疫抑制表型。
1.聚類16表現為高水平的PD-1 (CD279)、TIM-3、GranzymeB、CD27, CD95、HLA-DR、CTLA-4、ICOS (CD278)陽性表達，為耗盡的CD8+ T細胞簇。
2.聚類10、12和13的PD-1、CTLA-4和HLA-DR表達呈陰性，而聚類17的標記物表達模式與聚類16相同，但PD-1、ICOS、CTLA-4、HLA-DR和CD95表達水平較低。
3.聚類19高表達CD3、CD4和Foxp3，為Treg細胞簇，陽性表達PD-1、TIM-3、HLA-DR，高表達CTLA-4、CD28、CD27、ICOS。
聚類11、14、15和18的標記表達模式與聚類19相似，但表達水平較低(圖5C,E)。
分析不同聚類結果后，研究人員發(fā)現當將病人分成高low-abundance組,根據每個集群的頻率,浸潤T細胞的頻率,包括CD4 + T細胞、CD8 + T細胞亞群和PD-1 + T細胞在集群16豐富的集團,都顯著高于low-abundance組(圖5)。同時，聚16高豐度組PD-1+、TIM-3+和CTLA-4+免疫細胞的頻率也顯著高于低豐度組(圖5G)。簇16高豐度組的CD8+ T細胞、Tregs和巨噬細胞的免疫檢查點、共抑制受體和激活標志物表達水平顯著高于低豐度組。集群19的模式與集群16相似(圖5F,G)。這提示群集16和群集19可能與MIBC的免疫抑制微環(huán)境有關。
最近，一項共識分子分類(ConMC)總結了已發(fā)表的分類和6個亞型的聚合MIBC的優(yōu)點，該分類基于來自18個已發(fā)表的數據集的1750個MIBC轉錄組譜。ConMC為MIBC研究提供了一個新的框架。在本研究中，研究人員根據ConMC將38個樣本分為6個分子亞型，并在單細胞水平上分析6個分子亞型之間的TME特征。而6個分子亞型的TME組分無顯著差異，說明MIBC TME具有較大的異質性，ConMC并沒有為MIBC TME研究奠定基礎。
成像質量血細胞計數： 接下來，為了進一步分析MIBC TME的復雜性，研究人員進行了成像質量血細胞計數(IMC)，以探索基于空間分辨率的MIBC TME表型。觀察Pan-CK(上皮細胞)、I型膠原(細胞外基質)和CD45(免疫細胞)，以鑒定MIBC TME的形態(tài)學特征。在TME中，研究人員觀察了腫瘤細胞、免疫細胞和膠原蛋白信號的幾種主要空間表型。在腫瘤區(qū)域，出現兩種類型的tme;I型區(qū)域上皮細胞標志物Pan-CK和E-cadherin表達強烈(圖6A)。同時II型區(qū)域PanCK和E-cadherin表達缺失，提示腫瘤發(fā)生脫分化(圖6B)。它常發(fā)生在預后差的樣本中。
免疫細胞： 免疫細胞在MIBC TME中也表現出三種主要的空間分布模式。在I型區(qū)域富集的免疫細胞被腫瘤細胞排除，腫瘤細胞不浸潤腫瘤巢(圖6C)。II型區(qū)域招募了浸潤腫瘤巢的免疫細胞(圖6D)。III型區(qū)域免疫細胞較少(圖6E)。
膠原蛋白標記空間分布： 同樣，在MIBC TME中出現了四種主要的膠原蛋白標記空間分布模式。I型區(qū)包裹腫瘤巢的彎曲膠原纖維富集(圖6F)。II型區(qū)豐富的膠原纖維伸展并更平行于腫瘤邊界排列(圖6G)。III型區(qū)域含有定向分布的膠原纖維(圖6H)。IV型區(qū)域膠原纖維排列混亂，腫瘤邊界不清晰(圖6I)。這些結果表明，MIBC TME是高度復雜的；這就是為什么MIBC患者的治療反應非常不同。
在個性化精準醫(yī)療時代，根據分子特征對患者進行亞分組正成為決定癌癥預后和治療的關鍵因素。在本研究中，研究人員使用了CyTOF和IMC來研究MIBC TME的復雜性，揭示了TME的異質性特征，比之前相關研究所了解的更為復雜。研究人員揭示了MIBC的腫瘤細胞和免疫細胞的不同表型，并確定了與不良預后相關的特定腫瘤干細胞樣細胞簇。此外，本研究還分析了基于空間分辨率的免疫細胞表型和膠原蛋白特征。綜上所述，這個研究為今后的MIBC TME研究提供了資源，并可能為MIBC的精確治療提供方法。
