掃碼聯系客服
在介紹這篇文章之前，我想介紹這篇文章的“美女”通訊作者Aviv Regev。
生物學家，人類細胞圖譜（HCA）創始成員之一。她和Teichmann現在是人體細胞圖譜計劃（Human Cell Atlas）的聯合負責人。該項目計劃對人體各種細胞的RNA進行測序，然后使用這些基因表達譜將細胞分類，定義新的細胞，并繪制所有細胞及其分子在空間上的組織方式。Regev還熱愛細胞。無論怎么看，對她來說，細胞都是神奇而迷人的。
結果解讀：
為了描述持久性細胞的增殖動力學，作者研究了PC9肺癌細胞對第三代EGFR酪氨酸激酶抑制劑osimertinib的反應。PC9肺癌細胞編碼表皮生長因子受體(EGFR)的基因存在致癌突變。作者在最大效應(Emax)濃度(300 Nm)下處理細胞，并使用活細胞成像來量化治療過程中分裂事件的數量和時間，因為細胞要么經歷細胞死亡，要么受阻，要么形成可見的集落(圖1A)。為了確保來自集落形成譜系的細胞在作者的分析中不被過度表達，作者只跟蹤了每個譜系中的一個細胞。只有8%的細胞系產生了持久性細胞，其定義是在藥物治療的第14天存活的細胞(圖1B)。從根本不分裂的持久性細胞到經歷了7次分裂，持久性細胞分裂譜顯示了廣泛的異質性(圖1B)。這與未經處理的親代細胞群體形成對比，在親代群體中，所有細胞都經歷了細胞分裂(圖1C)。與以前報道的集落形成持續細胞很少一致，不到初始細胞群體的0.5%(持久群體的13%)產生了超過6個細胞的多細胞持久集落(圖1D)。因此，持續細胞包含一種在藥物治療早期出現的罕見的增殖亞群。
作者開發了Watermelon系統，這是一種高度復雜的條形碼慢病毒表達文庫，用于同時追蹤每個細胞的克隆起源以及增殖和轉錄狀態。要確定細胞在藥物治療中能否存活并恢復增殖能力的機制，需要在藥物治療前和藥物治療期間測量這些稀有細胞的細胞和分子特性。為此，作者開發了Watermelon系統，這是一個具有綠色和紅色熒光報告的高復雜性慢病毒條形碼文庫，用于同時追蹤克隆譜系以及種群中每個細胞的轉錄和增殖狀態。作者通過在mNeonGreen蛋白的3‘-非翻譯區定位克隆特異性表達的DNA條形碼來實現譜系追蹤，并通過稀釋強力霉素(Dox)誘導的H2B-mCherry轉基因來監測增殖歷史(圖1E)。作者生成了一個包含500多萬個條形碼的Watermelon系統文庫，并用它轉導了10,000個感染復數(MOI)小于0.3的PC9細胞，以最大限度地減少克隆之間的條形碼重疊。
作者通過比較短時間循環和非循環的持續增殖群體的osimertinib敏感性，測試增殖性持續細胞是否出現對EGFR抑制的穩定和較低的敏感性。作者用奧西美替尼處理Watermelon-PC9細胞14天，前三天在培養基中加入Dox。經過11天的Dox處理，在此期間，mCherry只在增殖細胞中被稀釋，作者對循環和非循環的持久細胞進行了分類(圖1F)。循環和非循環的持久群體都迅速恢復了藥物敏感性，這表明在持續藥物治療下循環的能力是可逆的，而不是遺傳突變機制(圖1G)。為了確定持久細胞增殖能力的潛在機制，作者用單細胞RNA測序技術(scRNA-seq)分析了56,419個Watermelon-pc9持久細胞在奧西美替尼治療14天的四個時間點(0，3，7和14天)的表達(圖2A)。作者使用已發表的signatures將每個細胞分配到特定的細胞周期時相(圖2B)，根據scRNA-seq檢測到的表達條形碼(圖2C)將細胞歸屬于譜系，并使用力定向布局嵌入(圖2D)。作者還根據相關細胞的輪廓將其歸類(圖2D)。與以前的報道一致，奧西美替尼在治療的第3天和第7天誘導G1期阻滯。在第14天，與中度循環細胞和非循環細胞(循環、中度循環細胞循環持續細胞分別有55%、36%和18%的細胞處于G2/M或S期)相比，循環持續細胞(根據mCherry稀釋度定義)具有更高的基于表達的細胞周期分數(圖2B) 與作者基于成像的分析一致，在第14天出現在持續細胞內的條形碼中，只有不到12%的條形碼是大規模克隆擴增的一部分(定義為在14天的檢測過程中至少增加了5倍) ( Fig.2C )。
ScRNA-seq圖譜表明藥物治療后細胞狀態逐漸改變，循環和非循環持久細胞遵循不同的轉錄軌跡，周期持久細胞的子集類似于未經處理的細胞(圖2D左)。治療過程中克隆大小動態檢測顯示克隆擴張，其中在循環持續細胞中觀察到的克隆大小增加最大 (圖2D，中)。幾乎三分之二的克隆有單一的命運，要么只產生循環的，要么只產生不循環的持久性細胞，而多命運譜系的出現頻率遠遠低于預期(圖2D，右)。第14天的單個克隆的大小在重復之間高度相關(圖2E)。
循環持續細胞比非循環持續細胞表現出更高的谷胱甘肽代謝和NRF2信號的表達，而非循環持續細胞的膽固醇穩態、干擾素-α和Notch信號特征的表達更高(圖2F) 在較大克隆的細胞中高表達的前十個相關基因中，有五個是氧化應激誘導轉錄因子NRF2的靶標(Fig. 2H)。與最近作者的差異表達分析和NRF2在微小殘留病中的作用的報告一致，敲除了編碼NRF2負調控因子的Keap1，增加了循環持續細胞的比例(圖2I)。用熒光ROS報告器CellROX對奧西美替尼處理的細胞進行分析，發現ROS水平隨時間顯著增加(圖2J)。與觀察到的兩個持久亞群之間的表達差異一致，第14天的循環持續細胞表現出不到非騎行人群測量到的ROS水平的三分之一(圖2K)。此外，當作者從第3天開始用活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)治療來緩解ROS (圖2L)，或者通過穩定過表達GPX2(圖2M)時，循環持續細胞比例明顯增加。用抑制對谷胱甘肽合成至關重要的胱氨酸-谷氨酸逆向轉運蛋白系統的erastin治療，反過來減少了循環持續細胞的比例(圖2N)。
對229種量化代謝物的主成分分析(PCA)將循環持續細胞、非循環持續細胞和未處理群體分開(圖3A)。有56種代謝物在三個種群之間差異豐富(圖3B)。特別是，作為線粒體β氧化底物的肉堿連接脂肪酸在循環持續者中比非循環持續者中要豐富得多(圖3C)。作者研究了放射性標記棕櫚酸氧化成3H2O的情況，以評估脂肪酸氧化(FAO)，并確實發現在奧西美替尼治療下，FAO的含量隨時間增加(圖3D)。接下來，作者測試了調節糧農組織途徑是否會影響持久者的增殖能力。在Watermelon-PC9細胞中過表達CPT1A，一種促進脂肪酸轉移到線粒體的限速酶，導致奧西梅替尼處理14天后循環持續細胞的比例增加了50%以上(圖3e)。與依托莫昔爾共處理11天，在對未處理細胞有最小抑制作用的濃度下，顯著減少循環持續細胞的比例(圖3F)和過敏性細胞的總體比例(圖3G)。與之一致的是，敲除CPT1C（一種在人類肺癌17中上調的基因亞型），而不是CPT1A，導致循環周圍細胞的比例減少(圖3H)。為了研究這些發現對其他周圍細胞的共性，作者從EGFR驅動的肺癌(PC9和HCC827)、HER2驅動的乳腺癌(BT474和EFM192A)、BRAF驅動的黑色素瘤(A375和COLO858)和結直腸(HT29)細胞系中另外建立了7個Watermelon模型，用臨床相關的激酶抑制劑(osimertinib、rapatinib或dradfenib)處理細胞10天，并對這些細胞進行分類(圖3I)。與之前的報告一致，這些圖譜按細胞特性分組，而不是按治療分組(圖3J)。在檢測到足夠數量(大于50個)的循環持續性細胞的五個模型中，有四個模型中持續性細胞的脂肪酸代謝(FAM)特征比非循環的相應細胞高(圖3k)。與PC9細胞相似，A375黑色素瘤細胞循環持續細胞與來自同一模型的非循環細胞相比，表現出更高的抗氧化反應基因和NRF2信號的表達(圖3L，M)。相反，循環HT29和HCC827持久細胞上調了其中一個，但不是兩個，這些ROS相關的信號(圖3L，M)。黑色素瘤(A375)和結直腸癌(HT29)循環持續性細胞的ROS水平也明顯低于同一細胞系的非循環細胞(圖3n)。
EGFR抑制也在體內引起了類似的轉變，就像在攜帶可誘導突變EGFR(L858R)的TRP53基因敲除小鼠模型中用奧西美替尼治療的微小殘留病(圖4A)一樣。一旦小鼠患上肺腺癌，作者就用奧西美替尼治療它們，直到腫瘤消退穩定下來，這表明殘留病灶很小(圖4A)。來自處理和未處理小鼠的樣本的批量RNA測序顯示，雖然處理導致整體細胞周期和EGFR信號特征的強烈下降，但極小的殘留疾病細胞上調了ROS和FAM基因特征的表達，這與作者的體外發現(圖4B)一致。FAM和ROS通路信號在從治療初期到殘留病灶再到進展的治療過程中都顯著且逐漸增加(圖4C，D)。ROS和FAM基因表達的增加與細胞增殖有關，并且在循環細胞中高于非循環的持久細胞(圖4E，F)。值得注意的是，在接受治療的樣本中，ROS和FAM signatures的相關性比未接受治療的樣本更強（圖4G）。為了測試患者對其他致癌激酶抑制劑的反應是否有類似的狀態，作者分析了另外兩種腫瘤類型的整體RNA-seq圖譜：在基線或接受BRAF抑制劑和MEK抑制劑22治療22天后收集的braf驅動的黑色素瘤；以及在基線治療或拉帕替尼治療2-3周后患者的her2驅動的乳腺癌（圖4H）。在HER2+乳腺癌中，FAM和ROS信號誘導僅與藥物治療相關（圖4I）。
本文小結：
總而言之，作者的結果說明了一種方法，不僅可以理解持久者循環能力的基礎是什么，而且還可以了解是什么驅動了其他臨床上重要的持久性特征，如復發時間，從而為開發延緩疾病復發的治療方法邁出了重要的一步。
