免疫治療的療效在消化系統癌癥中差異性很大，癌細胞擴增期間跟周邊環境存在著密切聯系，因此如果能將消化系統癌癥按照癌細胞周邊微環境組成進行分類的話，這對于癌癥患者的免疫治療方案設計有巨大幫助。今天就分享一篇這方面研究的文章《re-clustering and profiling of digestive system tumors according to microenvironment components》，于今年2月發表在Frontiers in Oncology（IF：6.244，2區）。

文章總體思路是利用公共數據庫里的基因表達數據進行癌細胞微環境成分組成分析，而后利用得到的各組成成分占比數據對病人進行聚類，而后結合臨床數據和突變數據探索得到的類別之間是否有顯著差異。

數據

• UCSC上下載的1526個病人的（已經normalized的）RNA-Seq和臨床數據
• 六種消化系統癌癥的突變數據
• 兩個免疫治療組數據

研究分析方向

計算癌細胞微環境組成

使用MCP counter基于基因表達數據計算8種免疫細胞和2種基質細胞占比，得到如下分布情況：

發現在6種消化系統癌癥中，fibroblasts占比最高，而NK細胞占比最低。同樣，通過下面的熱圖也可發現，基質細胞成分（fibroblast和endothelial）在微環境中富集程度較高：

而后，分析了微環境各個組成成分對生存預后的影響。首先，使用univariate Cox regression著重看了下各個微環境成分跟預后相關性:

而后用log-rank test畫生存曲線，來找出不同癌癥中與預后相關的微環境成分。

從上圖可以看出，LIHC, PAAD, READ三種癌癥中的微環境成分預后效果較差，而STAD中，neutrophils, endothelial, fibroblasts的預后效果顯著。

利用癌細胞微環境組成進行聚類

以前面MCP計算得到的微環境成分組成作為輸入，使用K means進行聚類，發現聚為6類時區分度最高：

而后分析了6個組別在6種癌癥中的占比：

通過上圖可以看出，cluster 4在ESCA中最為富集，而cluster 6在LIHC中最為富集，cluster 3在STAD中占比最高。而后通過Sankey圖進一步查看6個組別與6種癌癥之間的對應關系:

然后，文章通過熱圖探究了cluster和微環境組成成分之間的關系：

可以看出，cluster 3擁有最高的免疫細胞和基質細胞含量，而cluster 6則含量較低。

并且分析了6種cluster的生存預后效果：

發現cluster 1和3的預后效果較差，而cluster 6則有較好的預后效果。

cluster相關的基因突變

這里是在從基因組層面探索不同cluster之間的差異，使用的是SNP突變數據。鑒于上文發現cluster 3包含了大量非腫瘤微環境組成成分，并且大量分布于STAD，所以作者對比了STAD癌癥的cluster 3和其它cluster的driver基因突變。結果顯示STAD病人的cluster 3組別具有低TP53突變率和高LRP1B突變率，如下圖：

同理，由于LIHC具有大量cluster 6，作者分析了LIHC病人的cluster 6和其它cluster之間的基因突變差異。結果顯示cluster 6的病人具有更高的CTNNB1和TTN突變，如下圖：

仍舊同理，PAAD具有大量cluster 1，所以作者對比了PAAD病人的cluster 1和其它cluster之間的基因突變差異。結果顯示cluster 1具有更高的KRAS和SMAD4突變率，如下圖：

cluster之間的功能富集差異

文章挑選了70多個跟癌癥相關的通路并計算相應的ssGSEA得分。通過用熱圖來展示結果，可以看出跟腫瘤細胞行為調控和免疫相關的通路大量富集于cluster 3：

而后進行了一系列其它癌癥特質的對比分析。比如發現葡萄糖和脂肪代謝通路富集于cluster 6（見下圖），這可能是由于cluster 6主要由癌細胞組成。

而cluster 2的DNA復制和錯配序列修復則顯著高于其它cluster：

而cluster 3則集中于細胞活素類和受體互相作用，趨化激素，TGFB通路，VEGF通路，和粘著斑通路，這進一步說明了微環境因素可能會形成cluster 3病人的獨特臨床表征。

cluster 3與免疫抑制微環境的密切聯系

為了進一步探究cluster 3的病人的微環境特征，作者又進行了X-cell分析并通過熱圖展示結果：

結果顯示，免疫細胞和基質細胞在cluster 3富集。并且，cluster 3的微環境、免疫、基質分數均顯著高于其它cluster：

對于經典的免疫檢查點抑制劑，作者發現PD1, PDL1, CTLA4分子富集于cluster 3和5：

基質分數可以用于預測Anti-PD1/PDL1療效

鑒于前面發現的，cluster 3的微環境組成和免疫抑制狀況，作者認為cluster 3的病人對免疫治療不敏感。作者重新以微環境、免疫、基質分數表示cluster 3的病人特征，用以評估它們對免疫治療效果的影響。在Imvigor210群組中，文章發現當以微環境分數和免疫分數作為區分條件時，并沒有顯著差異：

而當以基質分數作為區分條件時，低分組的反饋效果要更高，而且ROC曲線也顯示了基質分數具有較好預測效果:

并且，對免疫治療有反饋的組比沒反饋的組的基質分數也要顯著高一些:

在GSE78220群組中，得到了類似的結果：

總結

整體來說，這篇文章的思路非常清晰、簡潔，適合作為范本。數據均來自公共數據庫，屬于可以“空手套白狼”，無需耗費經費做實驗，直接收集現成數據，而后做一個聚類，然后從各個角度去探究聚出來的類別之間的差異。至于有哪些“角度”，本文提供了幾個思路：臨床預后效果、基因突變、通路富集、免疫治療反饋等。相信大家很容易在此基礎上，發揮自己的聰明才智，寫出更精彩的文章。