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免疫療法是利用自身的免疫細胞來治療各種疾病，近年來其在腫瘤治療領域取得了顯著突破，特別是免疫檢查點抑制劑的開發，為很多癌癥患者帶來了生存的希望。然而，由于免疫系統本身在演化過程中擅長的是快速清除入侵機體的外界病原體，而在清除自身細胞來源的腫瘤仍然存在很多缺陷，特別是腫瘤細胞可以進化出多種免疫逃逸的能力。因此，想要完全將腫瘤細胞根除，現存的很多免疫療法仍然存在很多不足之處。除此之外，免疫檢查點抑制劑引發的一系列副反應也是限制很多癌癥患者使用其進行長期免疫治療的主要因素。因此，科學家急需一種可以有效清除腫瘤細胞，同時可以進行良好控制的免疫療法。在這樣的情形下，有研究者率先提出了CAR-T細胞的治療理念，也正是這種療法綜合考慮了上述兩種情況，因此成為了下個階段腫瘤免疫療法的一個重要發展方向。
嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptors，簡稱CARs）是一類具有強大傳遞信息功能的人工改造受體，它可以重新激活免疫細胞，行使靶向殺傷腫瘤細胞等功能，從而在臨床上具有廣泛應用。CARs的抗腫瘤效力是由其所設計連接的信號結構域所調控的。目前用于臨床的CARs包含一個核心T細胞受體（TCR）信號結構域，這一結構域來源于CD3，包含可以招募ZAP70激酶的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），以及共刺激信號免疫受體CD28或4-1BB。共刺激結構域自身包含多種信號基序，相應的短鏈多肽可以通過調節蛋白相互作用結構域（比如Src Homology 2, Src Homology3 等），與特異性下游信號蛋白相結合。這些多肽信號結構域也被稱之為線性結構域，是調控絕大部分信號受體的基石之所在。它們通過招募一系列信號蛋白，啟動不同的細胞響應。通過改造自身來源的T細胞，可以很好的規避各種排斥反應；同時可以通過多受體的改造理念，實現更精確的殺傷腫瘤細胞。
截至到目前，全球共有8款CAR-T產品獲批上市。其中，FDA批準上市的有6款，中國國家藥品監督管理局批準上市2款。如今，距最早一款CAR-T產品獲批上市已經過去了5年，產品的背后是科研工作者對CAR-T不斷的探索以及對其進行改造和完善。特別是近幾年CAR-T有一些革命性進展極大的推動了CAR-T細胞的臨床應用，下面Immugent就通過幾篇高分文獻，對CAR-T的發展歷程進行綜合解讀。
1. c-Jun 的過表達可誘導 CAR-T 細胞產生抵抗衰竭
在很長的一段時間內，科學家都是通過干預負調控T細胞的分子來實現增強CAR-T的功能，但是這種方式改造后的T細胞容易產生副作用且很容易走向衰竭，因此后續就有研究開始通過正向調控的分子來改造CAR-T。其中，最早的一項研究就是在2019年發表在Nature上的一篇文章，篇名為：c-Jun overexpression in CAR-T cells induces exhaustion resistance。在這項研究中，作者創新性發現c-Jun的功能缺陷介導耗竭的T細胞功能障礙，而過表達c-Jun的CAR-T細胞顯著對抗T細胞衰竭，有效解決了這一新興治療方式當前面臨的最主要障礙，為CAR-T療法更廣闊的臨床應用提供新思路。
圖1：
文章參考Long等構建的一個不經抗原刺激即誘導T細胞衰竭的可調節CAR信號模擬系統，即包含14g2a scFv序列和CD28信號結構域的神經節甘脂（GD2）受體（GD2-28z CAR），并在 GD2-28z CAR 質粒的 14g2a scFv 序列制造了一個點位突變以產生新的 CAR 受體（即HA-28z CAR），其對 GD2 表現出更高的親和性。與 GD2-28z 和不顯示可調節信號的 CD19-28z CAR-T 細胞相比，HA-28z CAR-T 細胞刺激后表現出更加明顯的衰竭，即出現體外擴增減弱、抑制性受體表達增加、效應分化增強、γ-干擾素（IFNγ）表達降低以及白介素-2（IL-2）表達顯著降低等情況。因此，研究人員認為，HA-28z CAR-T 細胞可作為研究人體 T 細胞衰竭的有效模型。通過利用轉座酶研究染色質可及性的高通量測序技術，對CD8+ HA-28z CAR-T 細胞和 CD8+ CD19-28z CAR-T 細胞序列進行分析，發現衰竭T細胞基因序列中的開放區域遠遠高于對照組細胞，而轉錄激活因子-1(AP-1)基序的可及性也大大增加。同時，衰竭細胞中的堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）和干擾素調節因子（IRF）的 mRNA 水平顯著升高，bZIP 家族和 IRF 家族中 JUNB、IRF4、BATF3 蛋白表達顯著升高。
圖2：
緊接著，作者發現過表達c-Jun并不在表觀遺傳學水平產生影響，而是顯著地改變轉錄組基因表達，其中，過表達c-Jun顯著改變 319 個基因表達，其中包括降低T細胞耗竭基因及增強記憶基因。隨后，研究人員實驗發現，冗余的AP-1-IRF復合體促進T細胞耗竭進程，而過表達c-Jun可減少或替換染色質中AP- 1復合物對抗該進程。最后，在Nalm6-GD2 +白血病小鼠模型中，研究人員發現JUN-HA-28z CAR-T細胞可增強抗腫瘤作用。同時，體外實驗證實，JUN-CD22-BBz CAR-T 細胞顯著提升炎癥因子的產生，并增強其抗腫瘤活性。總之，這項研究表明過表達c-Jun增強CAR-T細胞靶向實體瘤的能力，為CAR-T在實體瘤的臨床治療中提供了新思路。
2. BATF和IRF4協同抵抗CAR-T細胞走向衰竭
另一項著手通過干預調控T細胞正向功能分子的研究是在2021年發表在Nature Immunology雜志上的一篇文章，篇名為：BATF and IRF4 cooperate to counter exhaustion in tumor-infiltrating CAR T cells。這項研究和上一篇有類似之處，也有不同的地方，類似的是BATF和c-JUN類似，都屬于AP-1家族的分子；不同之處是在這項研究中，作者是通過同時干預兩個重要分子，從而達到更強大的協同抗腫瘤作用。本文通過小鼠腫瘤模型驗證了BATF和IRF4協同對抗T細胞衰竭。結果揭示BATF在CD8+ CAR-T細胞中過表達導致T淋巴細胞的生存和增殖顯著增加，增強了CAR-T在刺激后產生細胞因子和顆粒酶的能力，抑制細胞表面受體和耗竭相關轉錄因子TOX的表達。先前接受BATF轉導的CD8+ T細胞并排斥腫瘤的荷瘤小鼠產生了控制腫瘤復發的長期記憶T細胞，控制腫瘤復發。BATF可能通過使CAR-T細胞的表型和轉錄譜偏離衰竭從而增強效應功能，改善其抗腫瘤反應。操縱CAR-T細胞以更有效的方法來控制腫瘤并對其研究具有非常重要的意義。
圖3：
作者首先通過對CD8+T細胞中能夠增強NFAT/AP-1活性的轉錄因子的初步篩選，確定了JUN、MAFF和BATF，并提出了JUN、MAFF或BATF對CD8+ CAR-T細胞具有功能性抗腫瘤優勢的假設。作者通過靶向人CD19 (hCD19)的CD8+ CAR-T細胞轉導，以及JUN、MAFF、BATF逆轉錄病毒表達載體或空(pMIG)逆轉錄病毒做為對照，在腫瘤接種7天后過繼轉移到攜帶B16F0-hCD19腫瘤的C57BL/6J小鼠中進行試驗。與內源性蛋白相比，轉導后各轉錄因子高表達，但沒有改變Myc標記的CAR表達。隨后，在小鼠體內過繼pMIG或MAFF轉導的對照CAR-T細胞后，結果顯示腫瘤大小與單獨用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)處理的小鼠相似，而小鼠接受JUN轉導的CAR-T細胞顯示腫瘤生長的不同程度的延遲。為了進一步探索BATF轉導的CAR-T細胞的抗腫瘤反應，在腫瘤接種后12天將pMIG-或BATF轉導的CAR-T細胞轉移到荷瘤受體小鼠體內，并在CAR-T細胞轉移后8天收集TILs，與給予對照組pMIG轉導的CAR-T細胞的小鼠相比，給予BATF轉導的CAR-T細胞的小鼠腫瘤生長明顯放緩。經BATF轉導的CAR-TILs，通過Thy1.1報告基因的表達鑒定，與pMIG轉導的對照組細胞相比，在腫瘤中出現的頻率顯著增加。
圖4：
隨后，作者發現Ifnar1及其下游信號效應因子Stat1和Stat3以及Il12rb2的編碼基因，在BATF過表達的TILs中與對照TILs相比明顯上調。這些差異可能使BATF-過表達的細胞更容易接受干擾素-α/β和白介素-12 (IL- 12)信號，促進效應和效應/內存功能，增加其他效應功能相關基因(Icos和Gzma/b/c)的RNA表達。同時，作者證實這些結果與刺激后ICOS和GZMB蛋白水平的增加一致。此外還觀察到編碼CCL5、CCR2、CXCR3和CXCR6的mRNA表達水平明顯增加，編碼CCR7的mRNA表達降低。同樣與蛋白水平結果一致的是，經BATF轉導的CAR-TILs顯示出Tox mRNA的表達量減少，表明在通往衰竭的通路上的一個關鍵轉錄環節出現了斷裂。總體來說，這項研究中作者證實了CAR-T中過表達BATF促進了可控制腫瘤復發的長壽命記憶T細胞的形成，因此對即時和長期的抗腫瘤反應都有顯著的有益作用。
3. cBAF復合體和MYC聯合決定CAR-T早期命運
今年發表在Nature雜志上的一項篇名為；cBAF complex components and MYC cooperate early in CD8+ T cell fate的研究，則是發現cBAF復合體成分和MYC在CD8+ T細胞命運的早期中合作關系，這種關系共同決定了CD8 T細胞的功能分化。在這項研究中，作者通過使用基于CRISPR技術，對體內記憶T（Tmem）細胞生成負調控因子進行篩選。最終，研究人員確定了哺乳動物典型BRG1/BRM相關因子（cBAF）的多種成分。cBAF復合物的幾個成分對活化的CD8+T細胞分化為T效應（Teff）細胞至關重要，它們的丟失會促進體內Tmem細胞的形成。最終，作者證實了在活化的CD8+T細胞的第一次分裂中，cBAF和MYC經常不對稱地共同分配到兩個子細胞中。
圖5：
為了確定促進記憶T（Tmem）細胞的分子機制，作者首先使用基于CRISPR技術的改良實驗，對Tmem細胞生成負調節因子進行篩選。隨后通過多步驟的篩選，最終確定了哺乳動物典型BRG1/BRM相關因子（cBAF）的多種成分，并且它們能夠明顯影響Tmem細胞的形成。在此基礎上，作者T淋巴細胞的基礎生物學延伸到可能的臨床應用，并在此過程中探索深層分子機制。隨后，通過實驗作者發現，cBAF復合物的幾個組分對于活化的CD8+ T細胞分化為T效應(Teff)細胞是必不可少的，它們的缺失促進了體內Tmem細胞的形成。在活化的CD8+ T細胞的第一次分裂過程中，cBAF和MYC經常與兩個子細胞不對稱地共配。高MYC和高cBAF的子細胞向Teff細胞顯示細胞命運軌跡，而低MYC和低cBAF的子細胞優先向Tmem細胞分化。cBAF復合物和MYC物理上相互作用，在活化的CD8+ T細胞中建立染色質景觀。在活化的前48小時，即嵌合抗原受體T (CAR-T)細胞生成之前，用假定的cBAF抑制劑處理初代的CD8+ T細胞，可顯著提高小鼠實體瘤模型的療效。
圖6：
最后，作者通過小鼠腫瘤模型證實了具有高MYC和高cBAF的子細胞顯示出朝向Teff細胞的細胞命運軌跡，而具有低MYC和低cBAF的子細胞則優先向Tmem細胞分化。cBAF復合物和MYC的物理相互作用建立了活化CD8+T細胞的染色質結構。在產生嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞之前，用一種潛在的cBAF抑制劑在激活的頭48小時內處理新生的CD8+ T細胞，可明顯提高小鼠實體瘤模型的療效。這些結果確立了cBAF是Tmem細胞命運的負面決定因子，并表明在T細胞分化早期操縱cBAF可以改善癌癥免疫療法。影響CAR-T治療效果的因素除了輸入的T細胞容易走向功能衰竭之外，另一個主要原因就是沒有干性（記憶性）。因此，識別促進Tmem細胞的分子調控機制，對疫苗接種和CAR-T免疫治療中均有重要意義。
4. CD4+ CAR-T具有腫瘤殺傷性且長期存在
傳統的CAR-T細胞主要都是集中在能直接殺傷腫瘤的CD8+ T細胞上，上述解讀的CAR-T改造也都是針對CD8+ T細胞。下面介紹一篇有關CD4+ CAR-T的研究，相應的文章于今年發表在Nature雜志上，篇名為：Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells。這項研究主要是追蹤了在2010年接受了CAR-T細胞療法臨床試驗的兩名白血病患者，作為這項研究的首批參與者，他們的腫瘤細胞在后續治療后被完全清除。10年后，該研究機構的研究人員通過對這些患者的外周血進行檢測發現，CAR-T細胞在患者身體內仍可被檢測到。此外，輸注的CAR-T細胞隨著時間的推移發生了進化，在兩名患者身體中都出現了高度激活的CD4+ T細胞群，并且占據主導地位，這些細胞群繼續表現出腫瘤細胞殺傷特性。
圖7：
首先，作者使用流式細胞儀進行跨時間點檢測了CAR-T細胞的占比，同時使用定量PCR證實了兩名患者在所有時間點都存在靶點為CD19的CAR-T（CTL019）細胞。此外，對兩名患者最近一次血液測試顯示，10年后兩位患者的血液中仍然可以檢測到CTL019細胞，分別占所有T細胞的0.8%和0.1%，而CD19+的B細胞和CLL細胞則一直處于未檢測到或高度抑制狀態（小于1%）。為了探究CAR-T細胞擴增的克隆性質，研究人員通過分選CAR-T 細胞，對T細胞受體（TCR）β鏈庫進行深度測序（TCR-seq）以及慢病毒載體整合位點（LVIS）分析。TCR-seq揭示了患者1在2.3個月和1.4年時間點之間發生的克隆轉變。而患者2的克隆組成在前兩年逐漸轉變，總體上更加穩定，并且LVIS數據顯示基本與TCR-seq數據中觀察到的克隆轉變一致。
圖8：
最后，研究人員通過使用包含40種抗體的質譜流式細胞技術（CyTOF）在多個時間點分析了CAR-T細胞的表型。結果顯示，患者1在接受CAR-T細胞治療后的第1.8個月，CD8+ T細胞占CAR-T細胞的29.3%，并在之后的時間點按比例減少。而CD4+ T細胞在第1.4年占CAR-T 細胞的97.5%，第3.4年到9.3年（最晚時間點）占比甚至超過了99.6%;患者2表現出總體相似的趨勢。研究人員進一步研究發現，在兩名患者中，CAR-T細胞治療反應主要分為兩個階段：以CD8+ T細胞和CD4- CD8- Helioshi CAR-T細胞為代表的初始反應階段，以及以具有增殖性和溶細胞功能的CD4+ CAR-T細胞表型為主的長期緩解期。總之，這項研究系統追蹤了兩名患者體內CAR-T細胞的長達十年的比例變化、功能和分子特征。這些發現有助于研究人員了解與抗癌反應和白血病長期緩解相關的CD4+ CAR-T細胞特征，為患者疾病長期緩解提供了理論支持。
6.展望
CAR-T細胞療法已經在血液系統惡性腫瘤中取得了巨大成功，但目前尚未在實體瘤中取得成果,這主要是由于血液瘤與實體瘤之間存在著明顯的差異。例如，在實體瘤中存在較少的靶抗原。此外，許多實體瘤是“冷”腫瘤，免疫細胞對TME的浸潤性很差。由于免疫抑制的TME，即使有大量免疫細胞浸潤到腫瘤中，免疫細胞也不能很好的發揮作用。因此，通過改造CAR-T細胞，使其更適用于治療實體瘤是未來CAR-T細胞的主要發展方向。在實體瘤中一個主要面臨的難題就是腫瘤浸潤的T細胞很快走向衰竭而失去殺傷功能，從上述幾項研究也可以看出，無論是基于過表達 c-Jun、cBAF復合體，還是 BATF和IRF4配伍的CAR-T 細胞均顯示較好的對抗T細胞衰竭的特點。此外，不同于傳統的基于殺傷性的CD8 T細胞，CD4 T細胞也具有很好的發展潛力，CD4 T細胞不容易走向衰竭和良好的記憶性會是下一個CAR-T細胞的重要發展方向。特別是最新的一些研究發現CD4 T細胞也有一群殺傷性T細胞亞群（CD4-CTL），可以通過MHC-II分子直接殺傷腫瘤。
事實上，目前基于CAR的改造細胞理念已經不在局限于T細胞了。除了CAR-T細胞，還可以改造其它免疫細胞，如：CAR-NK, CAR-Macrophages等。與CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞有幾個優勢，包括免疫細胞來源豐富，沒有GvHD等優勢。然而與CAR-T細胞治療相關的大多數障礙也適用于CAR-NK細胞。由于CAR-T和CAR-NK細胞治療的這些障礙，最近 CAR-Macrophages已成為一種替代療法。雖然 CAR-Macrophages與CAR-T細胞有許多共同的特征和障礙，如對特異性抗原的需求、抗原逃逸和下調以及全身性細胞因子毒性等。然而，與CAR-T細胞相比，CAR-Macrophages在實體腫瘤治療兩個主要障礙上具有獨特的優勢：免疫細胞向TME的遷移和浸潤，以及逆轉免疫抑制性TME。每一種免疫細胞具有其特殊的功能，因此，在未來很有可能會將不同CAR免疫細胞進行混合，通過發揮它們各自的優勢來達到一個更加理想的協同抗腫瘤效果，讓我們拭目以待！
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