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預測免疫檢查點阻斷分類器識別對抑制PD-1和/或CTLA-4有反應的腫瘤
我們首先看這篇發布的期刊。這片文章發布在期刊: Clinical Cancer Research，這個期刊2021影響因子: 12.531。比去年上升了2.424。中科院大類: 醫學 1區，中科院小類: 1區 腫瘤學。
目的：
聯合應用抗-PD-1和抗-CTLA-4免疫檢查點阻斷（ICB）可改善患者的病情，但會發生嚴重的免疫相關的不良事件和承擔極高的成本。因此，迫切需要預測哪些患者對單一療法有反應，哪些患者需要聯合ICB 治療。
發現問題：
雖然目前可用的標記可以預測一般的ICB反應，但它們無法區分抗-CTLA-4或抗-PD-1在聯合作用下的反應，此外，這些分類器缺乏區分腫瘤細胞固有和腫瘤細胞外部(腫瘤微環境(TME)與基質)信號的能力。
背景知識：
在患者來源的異種移植黑色素瘤(PDX)中，人腫瘤微環境(TME)細胞迅速被小鼠細胞移植取代。作者使用XenofilteR deconvolution算法篩選了人類腫瘤細胞的RNA reads，隨后用計算機從大量(腫瘤細胞+ TME)患者的黑色素瘤RNA中減去它們。這產生了一個純腫瘤細胞固有特征(“InTumor”)和一個由腫瘤細胞外RNA序列(“ExTumor”)組成的特征。
提出假設：作者假設預測信號的框架應該包含獨立的腫瘤細胞固有和外在元素。
結果：
抗-CTLA-4或抗-PD-1治療對腫瘤和TME有不同的影響，因此作者認為，在構建基因表達標記來預測臨床反應時，應該考慮這兩種影響。計算機分析將來自患者(來自TCGA)的腫瘤和TME基因和來自PDX的基因的黑色素瘤RNA表達做比較，表明小鼠TME幾乎完全取代了人類TME在PDX生長后的第一個傳代(Fig. 1a)?；诨虮磉_的TME deconvolution工具和物種特異性抗體免疫組化染色證實了這一點(Fig. 1b-d)。
通過去除小鼠來源的序列，作者獲得了人特異性腫瘤細胞固有基因表達值。這些經過篩選的信號使作者能夠從患者的大量腫瘤(即腫瘤細胞+TME)基因表達信號中計算出腫瘤細胞內部的基因表達信號，從而建立TME基因表達特征(Fig. 2a)。這產生了一組767個在患者的大量黑色素瘤中表達的基因，這些基因(幾乎)是PDX所缺乏的(Fig. 2b)單細胞測序(scSeq)數據證實這些基因主要在非腫瘤細胞如T、B、NK和內皮細胞中表達(Fig. 2c)，這些數據表明，將xenfilter算法應用于PDX數據，可以計算分析腫瘤細胞和TME的RNA信號。
Figure 1. Human TME cells are replaced by mouse cells upon PDX grafting.
Figure 2. Computational dissection of tumor and TME signals from human Melanomas reveals an immune infiltration signature predicting response to anti-CTLA-4 monotherapy.
在TCGA中，患者黑色素瘤根據三個遺傳特征(“MITF-low”、“角蛋白”和“免疫”)進行分類。為了確定TME基因符合分類，作者僅使用這些TME和免疫相關基因對TCGA黑色素瘤樣本進行了聚類分析。結果顯示了與三種黑色素瘤亞群的高度重疊，這三種黑色素瘤的亞群以往便是作為大量腫瘤信號(Fig. 2d)。因此，通過計算從大量腫瘤信號中減去腫瘤細胞固有的基因表達信號，作者發現了數百個TME特異性基因信號，這些信號足以在兩個獨立的腫瘤數據集中概括黑色素瘤亞群的分類。這些結果說明了TME信號的重要性，表明TCGA對黑素瘤的分類在很大程度上是基于TME中腫瘤信號的基因表達信號，而不是腫瘤細胞固有信號。
本研究的主要目的是對聯合ICB治療生成預測分類器。以前，有人證明ICB應答同時受到腫瘤細胞固有因子和TME因子的影響，并且認為一個預測分類器應該包含這兩個不同的特征。在對TME基因行檢測時，作者發現將近一半的基因表現出高度的共調控，且與免疫相關。這一半的基因的表達與多種免疫細胞類型高度相關，包括T細胞(R=0.9)和B細胞(R=0.7) (Fig. 2e)。利用這些免疫相關基因，作者建立了 “外腫瘤特征”，并確定其是否能夠預測ICB治療的黑色素瘤患者的臨床結局，無論是抗-CTLA-4或抗-PD-1。作者用基因集富集分析(GSEA)分析在抗-PD-1單藥治療開始前隊列患者樣本的基因表達數據。Ex-Tumor標記未能顯示與該患者隊列的臨床結局相關。相比之下，在接受抗-CTLA-4單藥治療前的腫瘤試驗中，作者觀察到Ex-Tumor特征基因的高表達與臨床反應之間的顯著相關性(FDR <0.02, Fig. 2f-g)。在開始抗-CTLA-4治療前的一個獨立隊列患者樣本中驗證了這種相關性(Fig. 2h)，ExTumor特征再次與臨床結果相關，在有臨床療效的病人中有更高的表達并且ExTumor特征最高表達(最高四分位數)的患者總生存率更高(LogRank p = 0.028, Fig. 2i) 因此，ExTumor特征與抗-CTLA-4反應密切相關，而與抗-PD-1治療無關。
考慮到ExTumor標記無法預測對抗-PD-1治療的反應，作者研究了這種反應是否可以被腫瘤細胞固有因子預測，作者再次使用PDX信號(Fig.3a)并對腫瘤細胞固有RNA表達數據的主成分分析(PCA)，在PDX集合中，一個主成分與免疫相關信號通路(TGFb, IL2/STAT5和IFNg，)相關，并在治療開始前的患者樣本中顯示與抗pd -1應答相關(FDR = 0.097, Fig.3b) 來自這集合的基因被用來建立一個 “InTumor”基因表達標簽。它們富集了編碼細胞膜蛋白的基因，包括涉及“細胞-細胞信號”(NRP1, IL1B)、“炎癥反應”(NGFR, CCR1)和“信號轉導”(ITPKA)的基因。作者證實了InTumor標記對腫瘤細胞(而不是TME)基因是特異性的，表現為:(i)其在PDX和匹配的PDX細胞株之間的高度一致性。(ii)采用品種特異性抗體進行免疫組化。以及(iii)在使用TCGA數據庫時， InTumor特征表達與免疫細胞之間缺乏顯著相關性，接下來，作者確定了InTumor特征是否預測抗-PD-1的反應。為了排除非腫瘤細胞(在許多患者腫瘤序列數據中大量存在)的任何影響，作者首先將這一特征的基因數量減少到14個，與TME相比，在腫瘤中至少高出10倍的表達，然后，作者對抗-PD-1單藥治療前獲得的隊列患者樣本的基因表達數據進行GSEA，該分析顯示InTumor組中有大量無反應患者(Chi-square p < 0.05;Fig.3c) 而且，InTumor中預測的性能優于之前的三個（Fig. 3d。 在這個數據集中，只有EMT標簽優于InTumor。根據中值表達將患者樣本分成兩組，InTumorLO組患者的應答率為75%，InTumorHI患者的應答率為40%(Fig. 3e) 。在與TMB和ICB反應之間的關聯保持一致，這些預測意義重大，但并不嚴謹。這可以部分解釋為錯誤分類的預測應答者顯示明顯較低的TMB(Fig. 3f)。在第二組接受抗-PD-1單藥治療的皮膚黑色素瘤患者中也出現了相同的結果，證明了在治療開始前和治療中患者樣本中InTumor信號的預測能力。對于兩組治療前數據集，InTumorHI組和InTumorLO組之間沒有觀察到腫瘤突變負荷(TMB)的差異，未觀察到InTumor標記與抗-CTLA-4反應之間的聯系。因此，InTumor特征與抗-PD-1反應呈強烈的負相關關系，而與抗-CTLA-4無關。為了生物學上驗證InTumor特征和免疫敏感性之間的負相關關系。作者在最近建立的明確的活體環境中驗證這個特征是否預示了T細胞的死亡。作者從同一患者衍生出的中黑色素瘤PDX選擇了兩例，分別顯示低和高InTumor特征(Fig. 3g) 這些PDX被移植到小鼠體內，隨后用與TCR匹配的細胞毒性T細胞和過繼T細胞轉移(ACT)進行治療，這種設置允許作者在相同的TME和免疫浸潤條件下治療這些InTumorHI組和InTumorLO組。作者觀察到在InTumorLOPDX中可完全控制T細胞介導的腫瘤(M009;Fig. 3h) 相比之下，InTumorHI組PDX (M009R)的擴張呈指數級，與對照過繼T細胞轉移(ACT)難以區分(Fig. 3i) 。這些結果在四種不同InTumor評分的黑色素瘤細胞系中得到了證實。作者未觀察到反應與T細胞浸潤相關性。這些結果證實了InTumorHI信號與體內抗T細胞殺傷有關。
Figure 3. A tumor cell-intrinsic gene expression signature predicts invivo
response to T cell killing and to anti-PD-1.
預測抗-CTLA-4反應的ExTumor特征和預測抗-PD-1反應的InTumor特征的建立，使作者可以進一步研究這些特征是否單獨對聯合治療中抗-CTLA-4或抗-PD-1的臨床反應具有預測價值。由于ExTumor和InTumor信號單獨預測會低估了對聯合ICB有反應的人數，所以作者接下來確定了它們在一起使用時是否對聯合ICB有更好的預測能力(chi-square p=0.003, AUC = 0.92, Fig. 4a) 。在無進展期(PFS)案例中，聯合特征預測顯示對ICB聯合治療有效者和無效者存在顯著差異(logrank, p=0.0001, Fig. 4b)。最后，作者將InTumor和ExTumor特征結合起來，將它們劃分為應答象限，來確定對單藥治療(抗-CTLA-4或抗-PD-1)和聯合ICB治療(抗-PD-1+抗和抗-CTLA-4)應答的百分比(5 cohorts, n=131 patients, Fig. 4C) 無論是抗PD -1單藥治療還是聯合治療，這些隊列中患者的象限分類與臨床獲益顯著相關(Chi-square, p < 0.001 and p < 0.05, resp. Fig. 4c) 。更重要的是，該分析顯示，使用InTumorHI/ ExTumor分類的的患者對腫瘤的反應明顯更好。聯合(抗-CTLA-4+和抗PD-1)治療(80%的患者有臨床獲益)比單獨抗-CTLA-4或抗-PD-1治療有效（36% and 33% resp.,Chi-square p < 0.05, Fig. 4d）。此外，InTumorLO/ ExTumorLo組除了抗PD-1外，抗-CTLA-4也沒有顯著獲益(Chi-square p < 0.05, Fig. 4d)表明該ICB反應象限模型有潛力進行個性化反應預測，從而指導治療選擇。
Figure 4. Joint InTumor and ExTumor signatures predict response to ICB combination therapy.
全文小結：
作者使用自己開發的算法對來自小鼠和人類的基因表達信號進行篩選，這種方法獲得了腫瘤細胞來源的“InTumor”和腫瘤細胞外部的“ExTumor”基因表達譜。生物學上，作者證明，在小鼠中，具有高InTumor標記評分的黑色素瘤很難消除T細胞。InTumor標記預測抗-PD-1反應，而ExTumor預測抗-CTLA-4獲益。在PDX, InTumorLO，而不是InTumorHI中，細胞毒性T細胞有效地清除腫瘤細胞。當聯合使用時，InTumor和ExTumor標簽不僅識別出聯合治療比單藥治療有明顯更高的治療機會的患者，而且還識別出那些可能從抗-CTLA-4和抗-PD-1中獲益甚微的患者。
