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要想課題做的好，免疫分析知多少
試問近幾年生命科學領域最火熱的研究方向是什么，那免疫說第二，沒人敢說第一。免疫療法問世之初就得到廣泛關注，無論是國家自然科學基金委的資助方向，高校的研究探索，還是諸多藥物企業的先驅實驗，各大醫院的臨床實驗，全部都將重點聚焦在免疫研究中。免疫治療不只針對腫瘤本身，而是充分發揮免疫細胞的抗腫瘤活性，為腫瘤治療開辟出一條新思路。自其問世以來，包括派姆單抗，奧德武納武單抗等多款PD-1/PD-L1相關免疫治療藥物相繼在癌癥的治療領域取得突破性進展。今天小編想要和大家一起探討的便是免疫分析及其在生物信息學分析中的常用分析方法與研究思路。
1.免疫分析及其意義
腫瘤微環境主要由腫瘤細胞、成纖維細胞、免疫細胞、各種信號分子和細胞外基質及特殊的理化特征等共同組成，腫瘤微環境顯著影響著腫瘤的診斷、生存結局以及臨床治療中的藥物敏感性。不同免疫浸潤細胞的意義因腫瘤組織學而異，某些免疫亞群在某些腫瘤中顯示有益的預后作用，而在另一種癌癥中則顯示出有害影響。另外，不同免疫浸潤細胞的作用也不盡相同。比如M1巨噬細胞在各種類型的癌細胞中具有抗腫瘤作用，而M2巨噬細胞則恰恰相反。
癌癥免疫治療已經徹底改變癌癥治療，隨著新型免疫治療藥物的開發，免疫浸潤評估的重要性也在持續增加。抗CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗體對治療多種惡性腫瘤有效。然而，驅動這些響應的免疫微環境生物學機制尚未被完全理解。最近的研究發現，T淋巴細胞亞群(如CD8+)可以預測對現有和新興免疫療法的響應，進一步強調腫瘤相關免疫細胞作為潛在預測生物標志物的重要性。
2.免疫浸潤分析的常用方法及其比較
免疫浸潤分析是近幾年腫瘤研究領域的一個重要方向。目前常用的分析思路大多是基于基因表達譜數據，對腫瘤免疫微環境組分進行分析。主要的計算方法包括對marker gene的ssGSEA富集分析， 基于表達特征對細胞混合物進行反褶積的腫瘤浸潤免疫細胞量化方法，基于細胞組分和表達譜的同時反褶積的腫瘤浸潤免疫細胞量化方法以及基于NMF非負矩陣分解的腫瘤浸潤免疫細胞量化方法等。
圖1. 基于轉錄組學數據定量腫瘤浸潤免疫細胞的計算工具的特點
(M=標記基因，P=部分反褶積，C=完全反褶積)
2.1. 基于marker gene的ssGSEA富集分析的免疫分析方法
該方法將不同免疫細胞對應的marker genes作為基因集合, 采用類似GSEA的算法來評估樣本中高表達的基因在不同免疫細胞的基因集合中是否富集。其代表性研究工具包括xCell，MCP-counter，ESTIMATE等。
MCP-counter (http://github.com/ebecht/MCPcounter ) 是由Becht團隊于2016年開發的一個R包，該R包可以通過歸一化后的轉錄組數據量化異質組織中8個免疫細胞和2個基質細胞的絕對豐度。分數的高低可以顯示其在免疫微環境中的浸潤程度，細胞之間的豐度不可互相比較。
圖2. MCP-counter
MCP-counter的安裝與使用：
library(devtools)
install_github("ebecht/MCPcounter",ref="master",subdir ="Source")
library(MCPcounter)
input <- read.table("RNA-seq_data ",sep =" \t",header = TRUE,row.names = 1)
MCPcounter_estimate <- MCPcounter.estimate(input,featuresType = "HUGO_symbols")
#featuresType是確認轉錄組數據基因名的類型，包括"affy133P2_probesets"，"HUGO_symbols"和"ENTREZ_ID"。
heatmap(as.matrix(ExampleEstimates),col=colorRampPalette(c("blue","white","red"))(100))
另外，基于富集分析對免疫浸潤進行分析的常用方法還包括ESTIMATE（https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/index.html），其不能對特異性免疫細胞浸潤打分，只能分析免疫細胞，腫瘤細胞純度和基質細胞的豐度。
圖3. ESTIMATE
xCell（http://xcell.ucsf.edu/ ）基于從不同項目和研究的大規模表達數據中提取的489個基因集，對于每種細胞類型，通過反褶積整合基因富集分析對64種細胞類型進行xCell豐度得分評估，包括多個適應性和先天免疫細胞、上皮細胞和細胞外基質細胞等，其中包括48種與腫瘤微環境密切相關的細胞。xCell豐度分數不能直接解釋為細胞分數，但它們與真實的細胞比例具有很高的相關性。該方法適用于基因表達譜和傳統RNA-seq數據，但不適用于單細胞數據（推薦singleR）。
圖4. xCell中的細胞類型
2.2. 基于表達特征對細胞混合物進行反褶積的腫瘤浸潤免疫細胞量化方法
卷積和反卷積是深度學習中常見的算法，該方法將每個樣本看作是多種免疫細胞的混合，采用線性回歸擬合出每種免疫細胞的組分和表達量與最終混合后的關系，通過反卷積算法，提取每種免疫細胞的表達特征。基于表達特征對細胞混合物進行反褶積的方法包括TIMER2，Linear least squares regression，DeconRNASeq，PERT以及CIBERSORT等。其中TIMER2，CIBERSORT都是生物信息學分析中最為常用的免疫浸潤分析方法之一。
CIBERSORT（ https://cibersort.stanford.edu/ ）以及其升級版CIBERSORTX（https://cibersortx.stanford.edu/ ）基于表達特征矩陣從來自細胞混合物的表達數據推斷22種特定免疫細胞的豐度。與CIBERSORT相比， CIBERSORTx的高明之處不僅在于可以通過單細胞RNA-seq數據構建專屬signature（各免疫細胞marker基因），還能夠推測各免疫細胞特征基因表達譜，進一步將研究向機制方向伸展。
圖5. CIBERSORTX
EPIC（https://gfellerlab.shinyapps.io/EPIC_1-1 ）可根據表達數據分析出8種免疫細胞的浸潤比例，包括B細胞、 腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）、CD4+T細胞、 CD8+T細胞、 內皮細胞、 巨噬細胞和NK細胞。EPIC的算法思路是使用約束最小二乘回歸將非負性約束條件明確納入反卷積問題，并強加每個樣本中所有細胞分數的總和不超過一。其使用簡單，僅需提交RNA-Seq表達數據，設置參數，設置運行任務名稱3步即可完成。研究者可以直接在運行結果后分析各種細胞組分在樣本中的差異，比如當B細胞、CD8+T細胞、NK細胞比例顯著下降時，表明組織中的免疫反應被抑制，免疫細胞的招募過程受到阻礙，腫瘤免疫受到抑制；相反，CAF的增高則與腫瘤的發生發展密切相關。
TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org/ ) 是TIMER軟件的更新版本，是一個可交互式web工具，能夠更全面、靈活的對腫瘤免疫浸潤細胞進行分析以及可視化。TIMER2.0版本主要包含Immune, Exploration, Estimate三大模塊，可以手動輸入RNA-seq的基因TPM標準化值。TIMER2.0綜合TIMER, xCell, MCP-counter, CIBERSORT, EPIC和quanTIseq給出120個免疫微環境相關細胞的得分；另外該軟件還基于以上六種方法對TCGA數據庫中的所有樣本進行免疫浸潤分析，并提供多個可視化線上工具。
圖6. TIMER2.0
2.3. 基于細胞組分和表達譜同時反褶積的腫瘤浸潤免疫細胞量化方法
基于細胞組分和表達譜同時反褶積的腫瘤浸潤免疫細胞量化方法主要包括DSA和MMAD等。
DSA（https://github.com/zhandong/DSA ）是一種完整的反卷積算法，使用一組從混合組織樣本中提取在特定細胞類型中高度表達的標記基因，從而推斷復雜組織中的細胞組分和表達譜。
MMAD（http://sourceforge.net/projects/mmad/ ）是一種反卷積算法，當已知細胞比例或特征譜時，既可以執行部分反卷積，也可以基于標記基因進行完全反卷積。
圖7. MMAD
除以上分析方法外，還有基于NMF非負矩陣分解的免疫分析方法。該方法類似于突變特征分析，也可以用于從基因表達譜中提取免疫細胞表達譜特征。該策略對應的軟件和方法包括 deconf, ssKL , ssFrobenius等。
3. 免疫分析思路以及結果解讀
3.1.免疫分析與預后
免疫細胞浸潤與癌癥患者預后和多種藥物響應密切相關，比如這篇于今年8月發表在Front Cell Dev Biol的文章，便是基于CIBERSORT算法中的22種免疫浸潤細胞比例將葡萄膜黑色素瘤(UVM)患者分為不同的免疫細胞浸潤亞型，識別出不同免疫細胞浸潤亞型之間的差異表達基因，對差異表達基因進行無監督聚類以選擇最佳基因簇數，分析每個免疫細胞浸潤基因簇中免疫檢查點相關基因的表達，比較不同分數患者的細胞免疫浸潤情況，并進一步基于主成分分析（PCA）計算免疫細胞浸潤評分。
圖8.流程圖
A圖中條形圖顯示TCGA和GEO數據集中基于CIBERSORT算法的22種免疫浸潤細胞的比例。B圖為22種免疫浸潤細胞的相關性矩陣。紅色表示不同免疫細胞間豐度呈正相關，藍色表示負相關。C圖表明當k=2時亞型聚類的delta面積顯著減少，當k>2時，delta面積進入平臺期，所以k=2為最佳聚類系數。E圖為聚類結果，D圖表明不同免疫浸潤亞型的UVM患者預后不同，F圖表明不同免疫細胞浸潤亞型間腫瘤免疫浸潤細胞的比例存在差異。
圖9. 葡萄膜黑色素瘤中免疫細胞浸潤分布及其亞型特點
3.2.免疫分析與代謝
在腫瘤免疫治療的過程中，免疫分析從來不是獨行者。代謝和免疫是機體生存最基本的需求，在腫瘤細胞拼命與免疫細胞爭奪養分能源，努力代謝的同時，其代謝產物也會進一步抑制免疫細胞及其功能。國家自然科學基金委員會生命與醫學板塊于8月發布 “腫瘤免疫與腫瘤代謝”原創探索計劃項目，以更好探索腫瘤代謝與免疫治療之間的關系。比如這篇于今年7月發表在Advanced Science上，影響因子高達16+的文章，便是對HCC代謝-蛋白之間的互作進行充分分析，并基于代謝-蛋白互作網絡中的核心蛋白構建亞型分類器，結合單細胞分析，細胞系分析以及實驗分析等多種分析方法，對HCC代謝產物與TME之間關聯等代謝與免疫之間的關系進行探究。
在下圖的四套HCC數據中都可以觀察到，與C2相比，預后不良亞型C1中的代謝通路發生較大范圍下調和多個免疫通路的上調 (A)。免疫和代謝之間呈現負相關關系（B, C），且C1亞型表現出更高的免疫相關分數（D）。研究者推測C1缺氧亞型中癌細胞的快速增長可能取決于代謝產物的積累，尤其是不飽和脂肪酸,而不是糖酵解生成的代謝產物。此外，研究者還假設積累的代謝物(F)可能在上調HCC免疫通路中發揮一定作用。
圖10. 代謝和免疫調節之間的相互作用
3.3．免疫分析與免疫響應
腫瘤微環境和免疫治療響應密切相關，單細胞數據的發展為探索腫瘤微環境和免疫治療之間的關系提供極大幫助。來自NATURE COMMUNICATIONS的一份研究便是基于接受免疫檢查點（ICT）治療黑色素瘤患者的單細胞RNA測序數據集信息，從單細胞水平發現與免疫治療抵抗相關的免疫細胞亞群，并進一步識別不同免疫細胞亞群的基因表現特征：TREM2高表達的巨噬細胞亞群與ICT耐藥有關，并顯示獨特的基因組特征，包括高表達 SPP1，RNASE1，MT1G，SEPP1，FOLR2，NUPR1等；接著又利用多個公開RNA測序數據集對上述免疫細胞亞群基因表現特征在免疫治療應答的預測效能進行驗證，并借此開發出一個免疫治療應答預測特征，發現其具有良好的預測效能并優于其他免疫治療應答特征基因組合。
圖11. 黑素瘤中巨噬細胞的亞群與免疫相關基因表達
在今天的分享中，我們主要對免疫浸潤分析及其方法，以及一些經典的免疫分析思路進行介紹。同學們在自己的研究中切記不能生搬硬套，要做到活學活用，靈活掌握，在適當的地方添加免疫分析，為自己的文章添光加彩。
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