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哈嘍，各位guys，大家早上好。大早上的你是不是和小編一樣，在睡眼朦朧，昏昏欲睡呢？那就趕快來和小編一起來個高分文章提提神吧。37.8，37.8，37.8，記住這個數字，這個就是我們今天要看的文章，這個就是你我以后會發的文章（比較還沒睡醒，做做夢怎么啦）。今天和大家分享的是一篇發表在Molecular Cancer上的文章。Molecular Cancer這漲分速度真的是沒誰了，19年5+，20年12+，21年預測的又是漲了10+。37.8，37.8，37.8！沒看錯，這就是Molecular Cancer的最新預測影響因子。小編哭的好大聲，好羨慕。好想小編的銀行卡余額，股市里的基金能和Molecular Cancer一樣做火箭。然而現實卻是只有小編的體重做到了飛上天，和太陽肩并肩。
言歸正傳，我們還是回到今天的文章吧。
腫瘤免疫治療和CRISPR/Cas9基因編輯技術自誕生就以來，便吸引無數人的目光。同為21世紀最為重要的生物發現之一，一個斬獲2018年的諾貝爾生理學與醫學獎，另一個則在2020年的比拼中獲得諾貝爾化學獎。
腫瘤免疫治療已成為晚期惡性腫瘤治療的重要手段之一。與常規治療不同，它并不直接攻擊癌細胞，而是通過激活人體自身免疫系統來抗擊腫瘤，具有良好的安全性及耐受性。PD-1/L1 抗體藥物作為腫瘤免疫治療的代表藥物，在晚期惡性腫瘤治療中取得巨大的成功。CRISPR/Cas9基因編輯技術一經誕生就被視為生物技術的明星產物，由于其穩定高效，已經成為科研界和工業界實現基因組編輯的強大工具。
近年來，CRISPR技術和免疫治療的結合助力功能遺傳免疫-腫瘤篩選的應用與發展，并在識別潛在腫瘤-免疫相互作用調節因子中展示出驚人能力，并產生大量的遺傳免疫-腫瘤篩選數據。然而，很少有研究試圖系統地收集和分析它們。因此，本研究對腫瘤免疫相關功能篩選數據進行全面的收集與整合，并利用大規模基因組數據集進行綜合分析。
所以CRISPR技術和免疫治療熱點的強強聯合，又將碰撞出什么樣的火花，又將如何助力癌癥治療的發展呢？廢話不多說，快來和小編一起開啟今天的學習旅程吧。
Integrative analysis of CRISPR screening data uncovers new opportunities for optimizing cancer immunotherapy
CRISPR的綜合分析開啟癌癥免疫治療優化新篇章
1. CRISPR數據收集與整理
在本研究中，研究者共整理收集了17套針對免疫介導腫瘤治療相關調控因子的CRISPR篩選以及5套免疫檢查點封鎖藥物（ICB）處理的CRISPR篩選數據集合。腫瘤/免疫共培養系統的CRISPR篩選過程如圖1A所示。研究者選擇5種在免疫治療研究中最常見的癌癥類型作為研究對象，包括皮膚癌，乳腺癌和結腸癌等 (圖1B)。大多數篩選是在體外條件下進行的(76.47%)，DrugZ(47.06%)和MAGeCK(35.29%)是CRISPR篩選數據分析中最常用的兩種算法。
2. 抗腫瘤免疫相關調節因子的判定
基于以上CRISPR篩選數據，研究者通過sgRNAs豐度在免疫治療和控制組的倍數變化識別出潛在的抗腫瘤免疫響應調控基因。敲除后對抗腫瘤免疫響應有積極作用，使相應的腫瘤細胞對T細胞介導的殺傷產生抗性，富集其sgRNAs的基因被稱為敏感基因，如與抗原呈遞相關的基因。相反，敲除后促進腫瘤免疫逃逸，可以增強腫瘤細胞對T細胞介導的殺傷的敏感性，導致sgRNAs的耗竭的基因則被稱為耐藥基因，如CD274。基于以上假設判定每套數據中的免疫治療相關敏感基因和耐藥基因。然后將來自不同篩選的結果進行整合，只選擇那些在兩個或多個篩選中被識別到的基因進行進一步分析(圖1C)。最終，獲得181種免疫相關敏感基因和427個免疫相關耐藥基因的初步清單。
考慮到篩選結果的準確性，為獲得更可靠的候選調控因子，研究者通過三種已被證實的腫瘤免疫相關基因特征，包括免疫特征、細胞溶解活性(CYT)特征和MHC特征，進一步縮小該基因列表。首先根據TCGA pan-cancer的表達譜計算出這三個簽名的相應分數，并基于多組學TCGA數據，包括表達、突變和拷貝數變異(CNV)等確定患者的基因功能狀態是否失活。考慮到所有候選調控因子都來自于CRISPR敲除篩選的結果，研究者將功能喪失(失活)狀態定義為主要功能事件。然后，基于回歸的方法確定每個敏感/耐藥基因的功能狀態與每個特征的豐度之間的關聯，在控制癌癥類型和調整多重檢驗后保留有統計學意義的基因。三個特征的得分越高，表明抗腫瘤免疫反應越強。因此，根據敏感/耐藥基因的定義，敏感基因與這些特征打分負相關(失活時得分較低)，而耐藥基因應與這些特征正相關(失活時得分較高)。從結果可以看出，耐藥基因呈現出正向關聯比例較高的傾向。雖然不顯著，但這在一定程度上可以證明該方法的合理性(圖1D)。功能性敏感基因被定義為與所有三個特征打分具有顯著負相關的基因(n= 65)，而功能耐藥基因則被定義為具有顯著正相關的基因 (n= 40)(圖1E)。
圖1. 基于免疫-腫瘤篩選數據的整合分析，識別參與抗腫瘤免疫應答的調控因子
3. 功能性敏感基因和耐藥基因的功能分析
研究者進一步通過基于GO的功能相似性(FS)和注釋分析來確定這些免疫治療相關敏感基因和耐藥基因的功能特征。105個基因的功能相似性打分如圖2A所示。一般而言，與其他基因具有較高相似性的基因更有可能具有中心或更重要的作用。一些參與腫瘤免疫的關鍵轉錄因子基因，如STAT1和STAT2，與其他基因有較高的相似性。另外，通過敏感基因和耐藥基因的比較表明，耐藥基因具有更高的內部相似性。進一步的GO-BP富集分析結果表明，敏感基因更傾向于參與免疫相關過程，而耐藥基因則主要參與一些代謝和生物合成過程(圖2B)。
4.敏感基因和耐藥基因的失調模式
研究者探索這些基因在不同癌癥類型和免疫亞型中的異常表達模式。在腫瘤和正常組織中對這些基因進行差異表達分析。結果表明，兩種基因在不同癌癥類型間的差異不一致，敏感基因和耐藥基因在不同癌癥類型中的失活事件分布如圖2C所示。
研究者進一步描述這些基因的功能狀態與多類免疫亞型之間的關系(C1-C6)。為確定亞型特異性敏感基因和耐藥基因，研究者采用logistic回歸分析方法識別不同免疫亞型的特異性基因。最終識別出37個亞型特異性基因， 35個是敏感基因，包括2個C1特異性基因，10個C4特異性基因和25個C5特異性基因(圖2D)。基于import的GO信息對這些基因進行注釋，研究者觀察到多個C5特異性基因的失活事件與抗原加工和呈遞過程相關(圖2E)。敏感基因和耐藥基因在6種免疫亞型中的失活分布如圖2F所示。
圖2.敏感基因和耐藥基因的總體特征
5.敏感基因和耐藥基因在癌癥中的功能表征
敏感基因(如B2M)的缺失應使腫瘤能夠抵抗免疫攻擊，而耐藥基因(如CD274)的缺失則可能增強免疫細胞對腫瘤的細胞毒性作用。然而，這些基因的實際功能可能因癌癥類型的不同而不同。為描述每種癌癥類型中敏感基因和耐藥基因的實際功能，研究者設計一種計算方法(圖3A)。研究者首先手工整理除一系列具有抗/促腫瘤活性的免疫相關特征，包括免疫細胞、免疫檢查點基因和炎性細胞因子等，并基于回歸的方法計算敏感基因和耐藥基因的功能狀態（是否失活）與免疫相關特征豐度之間的關聯。敏感相關(S相關)特征被定義為與敏感基因負相關的抗腫瘤特征(失活時活性較低)或與敏感基因正相關的促腫瘤特征(失活時活性較高)。耐藥相關(R相關)特征則相反。因此，可以確定每種癌癥類型中每個敏感/耐藥基因的S / R相關特征的數量。從概念上講，具有更大S / R相關特征數的敏感/耐藥基因更可能在抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用。研究者還分別計算敏感/耐藥基因在不同癌癥中的S / R相關特征總數(圖3B, C)。B2M和TAP1等已知免疫調節因子，排名相對靠前。此外，研究者還發現耐藥基因比敏感基因具有更多的相關特征(圖3D)。
圖3. 敏感基因和耐藥基因在癌癥中的功能表征
6. MON2是新的免疫腫瘤治療靶點
為研究敏感基因和耐藥基因的功能狀態是否與癌癥患者的生存結局相關，研究者對所有105個基因進行Cox比例風險回歸分析。C2免疫亞型具有免疫炎癥表型，因此在該亞型腫瘤中，癌細胞與細胞毒性免疫細胞之間可能存在更多的相互作用。因此，對于C2亞型，敏感基因和耐藥基因的功能狀態對預后的影響更可能是通過抗腫瘤免疫相關機制介導的。3個敏感基因和10個耐藥基因與C2亞型預后顯著相關(圖4A)。此外，研究者在ICB治療的數據集中探討敏感基因和耐藥基因與預后的相關性。研究者共收集來自8個不同研究的10套數據集，然后將其集成到一個元數據集。在這些數據中，敏感基因和耐藥基因二分類功能狀態的定義與TCGA數據相似。元數據組的生存分析識別出5個敏感基因和4個耐藥基因(圖4A)。有趣的是，可以觀察到大多數敏感基因失活(75%)是不利的預后因素，而大多數耐藥基因(93%)失活與良好的預后相關。
考慮到某些基因本身的缺失可能不是通過影響抗腫瘤免疫響應，而是直接影響癌細胞的生存,研究者進一步基于癌癥基因依賴數據依賴圖譜數據庫(DepMap)對基因進行過濾。DepMap中提供一組包含739個癌細胞系基因被編輯后的平均CERES得分，研究者將CERES得分介于0.25到0.25之間的基因視為與腫瘤增殖無關基因 (圖4B)。通過綜合上述結果，耐藥基因MON2被確定為唯一的獨立增殖基因，它在TCGA C2和聯合ICB治療的數據中都與預后顯著相關(圖4C)。
7. MON2與抗腫瘤免疫的關系
研究者系統分析MON2在抗腫瘤免疫中的作用。MON2被17個CRISPR篩選中的兩套數據確定為重要的耐藥相關基因。鑒于其中一項篩選是在小鼠乳腺癌細胞中進行的，研究者在兩種人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF7中進一步驗證該發現。通過CRISPR/Cas9生成MON2缺失的腫瘤細胞，并與可以識別抗原- MHC I類復合物的TCR轉導的T細胞共培養。研究者觀察到，MDA-MB-231和MCF7細胞中MON2缺失的細胞比MON2豐富的細胞對T細胞的殺傷作用更敏感，這與小鼠細胞中CRISPR篩選的結果一致(圖4D, E)。此外，在多個ICB用藥數據集中，MON2的缺失與ICB響應相關 (圖4F)。并且，MON2表達與抗PD-L1/PD-L1治療的客觀緩解率(ORR)之間存在微顯著負相關(P= 0.093)，在一定程度上進一步印證上述結論(圖4G)。因此，抑制MON2可能導致抗腫瘤免疫增強，這可能為治療具有高MON2活性的腫瘤開辟新的可能性。
圖4. MON2與抗腫瘤免疫
8.構建CTIS預測免疫治療響應
以上研究結果表明敏感基因和耐藥基因在免疫細胞介導的腫瘤殺傷中發揮重要作用，研究者進一步基于這些基因構建一個能夠預測免疫治療響應的特征方法。圖5A為特征構建的詳細過程。首先研究者進行初步篩選，排除S / R相關特征小于100的基因(在所有癌癥類型中)，過濾后得到39個敏感基因和37個耐藥基因。在預處理樣本量最大數據集的基礎上，進行基于最小深度(MD)的隨機生存森林(RSF)分析，進一步縮小基因列表。RSF分析重復1000次，6個一致指數(C-index)值最大的基因被認為是最終候選基因。
其由4個敏感基因(JAK1、NFKB2、PPP6C和TNFRSF1B)和2個耐藥基因(PIGM和TPR)組成。然后，將四個敏感基因和兩個耐藥基因的平均表達差異定義為CRISPR篩選的腫瘤固有免疫評分，CTIS越高，表明抗腫瘤免疫反應越強。在訓練數據集和驗證數據集合中，CTIS顯示出較好的預后價值，更高的CTIS與更好的生存結局相關(圖5B-C)。
此外，研究者將CTIS特征與其他14個已發表的特征進行綜合比較。CD8、CYT等多種特征之間高度相關(圖5D)。相比之下，CTIS特征與其他特征的相關性相對較弱，表明它具有補充作用而不是替代作用。CTIS預測的整體效果較好，平均AUC值為0.620(圖5E)。
研究者進一步計算來自TCGA泛癌treatment-na?ve T數據中的CTIS，以表征CTIS在不同癌癥類型和免疫亞型中的分布。在6種免疫亞型中，C5的CTIS評分最低，符合其特征。
圖5. 構建CTIS預測免疫治療響應
9.確定潛在的OGs/TSGs調控網絡
致癌基因(OGs)或抑癌基因(TSGs)可能參與腫瘤免疫調控。因此，研究者認為構建敏感基因和耐藥基因的OGs/TSGs調控網絡可以揭示敏感基因和耐藥基因失調的潛在機制。OGs和TSGs的列表由OncoKB獲得，對于OGs，功能相關的事件被視為激活(0=不激活;1 =激活)。對于TSGs，功能相關的事件被認為是失活的(0=非失活;1 =失活)。研究者假設當敏感基因的表達在OG激活/TSG失活后顯著下調時，敏感基因與OGs/TSG之間存在關聯；相應地，當耐藥基因的表達在OG激活/TSG失活后顯著上調時，發現電阻與OGs/TSG之間存在關聯。敏感/耐藥基因和OGs/TSGs之間共有159種顯著關聯(圖6A)。有趣的是，研究者發現敏感基因傾向于與TSGs有更多的關聯(66.7%)，而耐藥基因則與OGs有更多的關聯(86.4%)(圖6B)。具有顯著相關性的OGs/TSGs被定義為腫瘤免疫相關的OGs/TSGs。
10.預測免疫療法的組合用藥
癌癥免疫治療的一個主要挑戰是提高腫瘤對ICB治療的響應。以往的實驗和臨床研究表明，組合治療策略可以顯著增加應答病例的百分比，并有助于顯著的生存獲益。研究者采用一種藥物預測的特征匹配方法，以識別更多與免疫療法協同的潛在聯合伙伴(圖6C)。由于查詢特征是該方法的基礎，首先收集可能與免疫治療相關的基因來進行藥物檢索，獲得另外5個經ICB處理的篩選數據。這些數據使用的實驗設計不同于ICB-na?ve篩查，而是將免疫治療干預引入到實驗中。因此，這些篩選可以識別可能介導ICB抗性或敏感性的潛在調控因子。隨后，研究者將敏感基因、腫瘤免疫相關TSGs、ICB增強基因整合到一個meta基因列表中，該列表中的基因被稱為positive調節因子。從理論上講，增強這些基因的功能可能與增強抗腫瘤免疫反應有關。negative調節因子與之相反 (圖6C)。另外，從CMap數據集中獲得藥物誘導后基因的表達變化。為確保該研究結果易于臨床轉化，研究者只選擇已經批準或已經通過I期和II期臨床試驗的藥物進行后續分析。研究者分別采用3種方法將查詢特征與藥物特征進行匹配，并利用基于順序統計量的方法對這些結果進行整合，得到穩健的藥物預測結果(圖6C-D)。在排名前10位的藥物中，有4個候選藥物都有過與免疫治療組合用藥的實驗或臨床研究報道，進一步證明預測的可靠性。
圖6. 預測免疫療法的組合用藥
CRISPR技術和免疫治療熱點的碰撞，是不是迸發出不一樣的火花呢？今天的文章沒有用到很復雜的算法和大量的生物實驗，但勝在新意和思路。同時結合CRISPR技術和免疫治療兩大熱點研究方向，對大量遺傳篩選-免疫響應相關數據集進行整理分析，挖掘免疫治療潛在調控因子，并構建免疫治療響應預測特征和預測免疫治療組合用藥方案。整份工作由大量的生信分析和少量生物實驗完成，“性價比”極高，誰叫生物實驗貴，耗時長 ，失敗率還高呢。
另外，小編還想和大家分享一個CRISPR技術相關的寶藏數據庫，腫瘤依賴性圖譜計劃（Cancer Dependency Map，簡稱DepMap，https://depmap.org/portal/，圖7）。
圖7. DepMap
DepMap項目是由Broad Institute與Sanger研究所進行戰略合作的一部分，該網站每個季度更新一次，速度快，時效有保證。通過該網站，研究者能夠分析broad institue和其他多個來源的數據，數據量非常豐富，包括 CCLE的多組學數據、broad項目（Achilles的基因依賴數據、PRISM的小分子敏感性數據、CTD）、Novart項目（drive）、sanger項目（Score和GDSC）和Gygi實驗室的質譜定量蛋白質組學數據。
在21Q4的數據中，研究者對不同來源的CRISPR數據和RNA干擾數據進行整合，并提供其相應細胞系的突變，表達等多維組學信息（圖8），非常好用！
圖8. DepMap數據
最后的最后，如果各位想對DepMap或者CRISPR數據的使用有更多的興趣和疑問，不妨看看由Mathew J. Garnett和Kosuke Yusa領銜的Wellcome Sanger Institute團隊的這篇文章吧（圖9）[2]，該工作利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，在30個癌種的324種癌細胞系中分別敲掉18,009個基因，首次實現從基因組規模的水平上，以數據驅動的方式，尋找有效的抗癌靶點。正是CRISPR技術的開發和應用讓癌細胞徹底暴露自己的弱點，數千個癌細胞生長不可或缺的基因被發現，其中628個基因是非常有潛力的抗癌靶點。
圖9. CRISPR-Cas9優化癌癥治療靶點
好啦，各位小伙伴，今天的內容就是這些，我們下次再見啦。
參考文獻：
1. Integrative analysis of CRISPR screening data uncovers new opportunities for optimizing cancer immunotherapy
2. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR Cas9 screens
