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大家好，看過許多腫瘤分子分型的文章，今天我們換個(gè)角度，從腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的角度去解讀一篇肺癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分子分型的文章，2021年10月7日，由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院、美國(guó)麻省總院癌癥中心的胡海川博士等研究機(jī)構(gòu)合作在《Cancer Cell》上發(fā)表了名為“Three subtypes of lung cancer fifibroblasts defifine
distinct therapeutic paradigms”的文章，這篇文章從腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）的角度創(chuàng)新性的研究出肺癌中的一個(gè)新的獨(dú)立分子分型，系統(tǒng)的闡述了CAFs在功能水平上的異質(zhì)性，通過對(duì)CAFs的分子分型，全面揭示不同亞型的臨床意義。
文章亮點(diǎn)：
1.來自非小細(xì)胞肺癌患者的CAFs生物庫(kù)重現(xiàn)了臨床CAF異質(zhì)性
2.NSCLC CAFs的治療譜揭示了三種不同的功能亞型
3.I型和II型CAFs具有較高的HGF和FGF7表達(dá)，對(duì)癌細(xì)胞有保護(hù)作用
4.亞型III 型CAFs與更好的臨床反應(yīng)和免疫細(xì)胞遷移有關(guān)
前言：
腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境中最主要的成分之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著必不可少的作用。骨髓和脂肪的局部組織固有成纖維細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞是CAFs來源的主要前體細(xì)胞。大量研究表明，CAFs并不作為單獨(dú)細(xì)胞在腫瘤周圍存在，而是和腫瘤細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與存活并維持其惡性傾向。腫瘤細(xì)胞可以影響CAFs前體的招募，并誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞活化為CAFs；同時(shí),CAFs可以分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤的預(yù)后。CAFs還參與血管淋巴管的生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、免疫抑制以及腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等有利于腫瘤發(fā)生發(fā)展的外源性途徑，為腫瘤細(xì)胞提供了一個(gè)良好的微環(huán)境。大量研究顯示，研發(fā)靶向CAFs的藥物可以中斷其與腫瘤細(xì)胞之間的聯(lián)系，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，深入了解CAFs促腫瘤的作用機(jī)制將有利于腫瘤治療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。
肺癌精準(zhǔn)治療發(fā)展史：
靶向治療：
抗血管生成 在一線及二線治療中，使用抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF) 貝伐單抗或抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）雷莫蘆單抗與化療聯(lián)合均可以延長(zhǎng)總生存期。 貝伐單抗，目前使用僅限于非鱗癌，聯(lián)合含鉑雙藥是指南推薦的治療策略。 尼達(dá)尼布，既能夠抗 VEGFR 又是多種酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)，它與二線化療方案聯(lián)用可以延長(zhǎng)非鱗癌患者生存期。
EGFR 突變 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）吉非替尼和厄洛替尼在一小部分患者中的療效獲得了戲劇性的突破。在 EGFR 突變的患者中, 比較三種 EGFR TKIs（吉·非替尼、埃羅替尼或阿法替尼 ) 與以鉑類為基礎(chǔ)的化療治療 NSCLC 的療效。結(jié)果見下表： 所有結(jié)果表明：EGFR TKIs 戰(zhàn)勝化療成為 EGFR 突變 NSCLC 的一線治療（更高的 ORR、更長(zhǎng)的 PFS、更低的毒性、更好的生存質(zhì)量）。 不幸的是，肺癌仍然不能被治愈，因?yàn)樗械姆伟┳罱K還是會(huì)發(fā)生腫瘤進(jìn)展，最常見的原因是突變耐藥。50%～60 耐藥為T790M 位點(diǎn)突變患者，因 T790M 突變對(duì)厄洛替尼、吉非替尼耐藥后，第三代 TKIs 奧希替尼可以提高 ORR。因此當(dāng)一線靶向治療失敗后決定是否使用奧希替尼進(jìn)行二線治療時(shí), 必須知道患者 T790M 突變情況，如果發(fā)生突變，方可以改用奧希替尼。
ALK 基因突變 ALK 突變的比例在 NSCLC 中約為 3%～5%，克唑替尼是目前治療 ALK 陽性癌癥患者最為有效的藥物，服用前必須做 ALK 基因檢測(cè)，對(duì)該類型患者 ORR 達(dá)到 50% 左右，與化療相比，可獲得更長(zhǎng)的 PFS。
其他除 ALK 基因突變外，肺癌患者還可能存在 ROS1、MET、BRAF (V600E)、HER2 、RET 基因突變，目前以上述基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物尚在臨床試驗(yàn)中，并未在國(guó)內(nèi)上市，相關(guān)藥物及現(xiàn)階段試驗(yàn)結(jié)果見下表：
參考文獻(xiàn)：Karnofsky Award 2016: A Lung Cancer Journey, 1973 to 2016，http://ascopubs.org/doi/full/10.1200/JCO.2016.70.4064.
結(jié)果解讀：
建立一個(gè)PDF（患者源成纖維細(xì)胞）庫(kù)，充分捕獲非小細(xì)胞肺癌CAF異質(zhì)性，NSCLC CAF異質(zhì)性決定TKI治療療效發(fā)現(xiàn)
為了捕獲非小細(xì)胞肺癌中CAFs的多樣性用于功能研究，研究人員從含有EGFR突變或ALK融合等靶向致癌驅(qū)動(dòng)因素的非小細(xì)胞肺癌的活檢中建立了大量患者源性成纖維細(xì)胞(PDF)，首先檢查了非小細(xì)胞肺癌中CAFs的表型異質(zhì)性程度。與不同腫瘤間質(zhì)的不同病理組織學(xué)表現(xiàn)相似（圖a）。pdf在形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)模式方面表現(xiàn)出相當(dāng)大的差異（圖c），為了更深入地了解這些模型的多樣性和保真度，研究人員對(duì)這些PDF模型中10個(gè)CAF標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行了表達(dá)特征分析（圖e），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)COL1A2或ACTA2 mRNA水平與活檢時(shí)患者年齡的相關(guān)性強(qiáng)，根據(jù)腫瘤活檢部位顯示S100A4或PDGFRA mRNA水平的相關(guān)性強(qiáng)（圖f），研究人員分析了來自切除的nsclc的代表性scRNA-seq數(shù)據(jù)集的1465個(gè)成纖維細(xì)胞，包括肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌中的CAFs 。統(tǒng)一流形近似和投影(UMAP)顯示了7種分子類型，UMAP-1到UMAP-8, UMAP-4由于數(shù)據(jù)集中單細(xì)胞質(zhì)量較差而被排除在外（圖h），這些分析表明，pdf文件差異表達(dá)獨(dú)特的UMAP標(biāo)記基因，并共同概括了臨床NSCLC CAFs的所有七個(gè)分子類別(圖i)。這些患者由于接受EGFR和ALK治療后產(chǎn)生了耐藥性，研究人員利用二者的耐藥水平和耐藥機(jī)制發(fā)掘CAFs的差異，發(fā)現(xiàn)了HGF-MET和FGF-FGFR通路，得出結(jié)論，CAFs主要利用這兩條通路在不同程度上造成的耐藥，可進(jìn)一步影響藥物的治療，這為后續(xù)精準(zhǔn)藥物的研發(fā)奠定了很好的基礎(chǔ)。
NSCLC CAF異質(zhì)性決定TKI治療療效
在晚期NSCLC中，EGFR的致癌突變和ALK的融合分別存在約20%和5%，為了弄清CAFs是否以及在多大程度上影響對(duì)EGFR TKI治療的應(yīng)答，研究人員將EGFR突變(以下簡(jiǎn)稱EGFR+)癌細(xì)胞MGH707與各種pdf共培養(yǎng)。在沒有pdf文件的情況下，EGFR TKI osimertinib (EGFRi)有效地阻斷了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖a)。與某些pdf共培養(yǎng)基本上維持了EGFRi治療后癌細(xì)胞的增殖，而其他pdf僅提供適度或無保護(hù)(圖a)。通過相應(yīng)的pdf條件培養(yǎng)基可以充分復(fù)制pdf影響的多樣性(圖2a)，這在7個(gè)pdf結(jié)合6個(gè)癌癥模型的隊(duì)列中得到了證實(shí)(圖b)。這些結(jié)果表明，pdf在決定egfr治療的整體療效方面發(fā)揮著重要作用。這種效果是異構(gòu)的，并且是依賴于PDF的，支持PDF函數(shù)的多樣性。這些結(jié)果也表明pdf的拯救效應(yīng)主要是由可溶性因子介導(dǎo)的，因此利用培養(yǎng)基對(duì)pdf進(jìn)行高通量分析。研究人員進(jìn)一步調(diào)查了38份來自EGFR+ NSCLC活檢的pdf，并評(píng)估了它們對(duì)三種使用EGFR治療的EGFR+腫瘤模型的挽救能力(圖c)。pdf與堿性NSCLC融合展示了一系列救援效果篩選+治療非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株篩選TKI lorlatinib(乙醇),即幾個(gè)pdf救出所有篩選+癌癥模型和其他pdf獲救的只有一些堿+癌癥細(xì)胞系(圖d-e)。這里的數(shù)據(jù)支持癌細(xì)胞有不同的能力和偏好利用鈣生成的分泌因子。重要的是，CAF功能的異質(zhì)性neity是一個(gè)關(guān)鍵因素，它決定了特定的背景和癌癥-CAF交叉的強(qiáng)度，而這些交叉是對(duì)整體TKI反應(yīng)的貢獻(xiàn)。
HGF和FGF7的表達(dá)定義了三種不同治療策略的CAFs亞型
由于MET和FGFR反復(fù)且有效地介導(dǎo)了cafedriven EGFRi耐藥，研究人員接下來根據(jù)它們激活這些通路的能力對(duì)pdf進(jìn)行了分類。我們首先在另一種基因環(huán)境(ALK+)中測(cè)試了PDF的拯救能力，發(fā)現(xiàn)無論其原始腫瘤的致癌背景如何，對(duì)EGFRi具有顯著抗性的PDF也是ALKi的強(qiáng)大拯救者。因此，研究人員分析了所有60份pdf文件的EGFR TKI拯救譜，包括22份來自非EGFR+ nsclc的pdf文件，并確定了三種不同的CAFs功能亞型:亞型I通過MET穩(wěn)健且廣泛拯救EGFR，伴或不伴FGFR(包括CCD19-Lu);
亞型II主要通過FGFR獲得較溫和的拯救;
亞型III的挽救作用最小(圖a-b)。
通過對(duì)19份pdf(包括13份來自ALK+腫瘤)的隊(duì)列研究，我們一致發(fā)現(xiàn)，亞型I和II型pdf能夠通過ALKi挽救ALK+腫瘤，而亞型III型pdf則可以獲得更好的應(yīng)答(圖c)。這三種功能定義的CAF亞型說明了克服CAF介導(dǎo)的治療耐藥的不同治療策略:需要met加FGFR通路阻斷來對(duì)抗I亞型CAFs的影響，II亞型CAFs需要FGFR通路阻斷，III亞型CAFs不需要聯(lián)合治療。至此，研究者將肺癌CAF定義為三種亞型：第I類以HGF-MET及FGF7-FGFR2為主要機(jī)制造成耐藥，并可給予MET抑制劑和FGFR抑制劑以強(qiáng)化腫瘤治療；第II類CAF以FGF7-FGFR2為主要機(jī)制造成耐藥，并可給予FGFR抑制劑以提升腫瘤療效；第III類CAF不造成或僅導(dǎo)致微弱腫瘤耐藥，進(jìn)而不需要進(jìn)一步干預(yù)。有趣的是，第III類CAF還能增強(qiáng)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞遷徙，并與腫瘤病灶中CD8+ T細(xì)胞豐度相關(guān)，可能會(huì)對(duì)后續(xù)免疫治療策略的改進(jìn)有幫助。
對(duì)肺癌CAF功能亞型與腫瘤耐藥、免疫相關(guān)的相關(guān)性研究
圖1
圖2
接下來研究人員通過RNAseq分析，對(duì)亞型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ做了差異分析，KEGG、GO富集（圖1a-b），與亞型Ⅲ PDFs相比，I亞型和II亞型PDFs中有3個(gè)通路與基因過表達(dá)相關(guān)，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b (TGF-b)信號(hào)通路，具有較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1c)。研究人員發(fā)現(xiàn)它主要是上游但不是下游的基因,在接頭的TGF-b1 類型I和II pdf文檔,包括decorin(寬帶),fibromodulin(作用)和latent-TGF-b-binding蛋白1 (LTBP1)(圖1d)。值得注意的是，TGF-b1本身在所有三種亞型CAFs中表達(dá)相似(圖d)。因此推測(cè)，亞型I和II型pdf可能具有較低的TGF-b信號(hào)活性，因?yàn)樗鼈冞^表達(dá)了這些抑制因子。信號(hào)分析證實(shí)，TGF-b信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)phospho-SMAD2和phospho-SMAD3在亞型III pdf中顯著存在，但在亞型I和亞型II pdf中僅有少量存在(圖1e)。與亞型IIpdf相比，亞型I和亞型IIIpdf在SMAD2和SMAD3總水平上似乎也具有更高的變異性(圖1e)。接下來，研究者研究了TGF-b信號(hào)是否控制HGF和FGF7的表達(dá)。成纖維細(xì)胞TGF-b信號(hào)的丟失與小鼠體內(nèi)HGF分泌增加和旁分泌MET激活有關(guān)。在人肺CAFs中，TGF-b1治療抑制了I和II亞型pdf中HGF和FGF7的表達(dá)(圖1f-g)，并降低了它們產(chǎn)生EGFRi耐藥的能力。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，CAFs固有的TGF-b信號(hào)通路有助于成纖維細(xì)胞的功能異質(zhì)性，部分是通過轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，包括ETV1和TBX2。免疫檢查點(diǎn)阻斷已成為非小細(xì)胞肺癌的主要選擇。除了癌細(xì)胞的內(nèi)在因素(例如，突變負(fù)擔(dān))，成纖維細(xì)胞也可能影響腫瘤的免疫背景，接下來研究了CAF功能分類是否與患者腫瘤免疫狀態(tài)相關(guān)，所有TIL+活檢均有亞型pdf，而亞型Ⅰ和亞型Ⅱpdf僅在TIL活檢中存在，盡管可能由于樣本量小，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2a)。與亞型I和亞型ⅡPDFs相比，亞型III PDFs表達(dá)了多種對(duì)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞具有趨化特性的趨化因子，包括CXCL11、CXCL12、CCL14、CCL17和CCL20，且表達(dá)水平更高(圖2b)。為了從功能上分析和驗(yàn)證CAFs的影響，研究人員設(shè)計(jì)了一種體外微流體分析方法來概括免疫細(xì)胞遷移過程。簡(jiǎn)而言之，PDFs被嵌入I型膠原中，這是肺癌組織中表達(dá)的主要膠原類型，然后將免疫細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在模擬腫瘤毛細(xì)血管的外周通道中(圖2c-d)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，除了確定靶向治療的反應(yīng)外，CAF功能分類也與不同水平的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)(圖2g)。隨著對(duì)其生物學(xué)和臨床影響的進(jìn)一步了解，這里觀察到的現(xiàn)象也可以幫助設(shè)計(jì)癌癥免疫療法。
判斷CAF功能分類與臨床預(yù)后的相關(guān)性
接下來，我們通過分析三個(gè)患者隊(duì)列來檢驗(yàn)CAFs的功能亞型是否與患者的臨床反應(yīng)相關(guān)。在第一個(gè)隊(duì)列中，我們從12名隨后接受共價(jià)EGFR TKI治療的EGFR+ NSCLC患者中獲得了治療前活檢培養(yǎng)第一周條件培養(yǎng)液中的分泌組(因此分泌譜更類似于原始腫瘤)(圖a)。與先前研究結(jié)果一致，對(duì)EGFR TKI反應(yīng)差的患者腫瘤分泌組中HGF和FGF7水平較高(圖a)。對(duì)于第二組13例患者(圖b)，我們從他們首次使用共價(jià)EGFR TKI治療前的活檢中建立了pdf文件。通過比較PDFs體外拯救表型和相應(yīng)患者的臨床反應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)，與PDFs分類為亞型或亞型的患者相比，含有亞型CAFs的腫瘤患者更有可能對(duì)EGFR TKI產(chǎn)生應(yīng)答(圖b)。對(duì)于第三個(gè)獨(dú)立的EGFR+ NSCLC隊(duì)列，我們分析了從11名患者接受奧西美替尼治療前后的活檢中獲得的公共RNA-seq數(shù)據(jù)集。我們進(jìn)一步證實(shí)，有限應(yīng)答無進(jìn)展生存期的NSCLC患者在奧西替尼前活檢中HGF和FGF7的表達(dá)更高(圖c)。對(duì)于反應(yīng)較好的患者(PFS >12個(gè)月)，HGF和FGF7的表達(dá)通常在奧西替尼(耐藥)后活檢中增加。一致發(fā)現(xiàn)HGF和FGF7的間質(zhì)豐度在疾病和治療過程中是動(dòng)態(tài)的(圖d)。這些發(fā)現(xiàn)表明腫瘤微環(huán)境的進(jìn)化是對(duì)治療壓力和/或疾病進(jìn)展的反應(yīng)。因此，研究人員進(jìn)一步分析了來自6名患者縱向活檢的pdf，這些患者在兩次活檢之間至少接受了一條TKI治療線。從后期活檢中獲得的pdf通常比最初活檢中獲得的pdf更有說服力(圖e)，研究人員通過4個(gè)獨(dú)立的臨床隊(duì)列驗(yàn)證了三個(gè)CAF功能亞型具有知道臨床預(yù)后的重要價(jià)值。
文章小結(jié)：
這個(gè)研究從成纖維細(xì)胞的角度對(duì)癌癥進(jìn)行了亞型的分類，不僅在分子分型的角度對(duì)癌癥治療進(jìn)行了研究，還和腫瘤耐藥，免疫治療，患者預(yù)后等多個(gè)臨床治療的問題相聯(lián)系，為肺癌精準(zhǔn)治療提供了新的思路，創(chuàng)新性的手段也為之后的腫瘤精準(zhǔn)治療提供了思路與借鑒，有望進(jìn)一步提高腫瘤的緩解與治療療效。
