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                                                                    下呼吸道菌群失調影響肺癌進展

嗨咯~大家好呀，今天小編給大家帶來一篇今年發表在Cancer Discov.（中科院JCR分區1區，IF: 39.397）的高分文章，本研究干濕結合，相得益彰，一起來欣賞學習大佬的研究成果吧！

研究背景及意義

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，其發病率和死亡率高居不下。靶向治療可以提高患者的生存率，然而其僅適用于約30%的肺腺癌患者。免疫治療新療法已被證明可影響患者體內T細胞對腫瘤抗原的反應，并提高肺癌患者的生存率，然而仍有40%~60%的患者對其無效或產生耐藥性。已有研究在小鼠實驗和對免疫治療反應的癌癥患者的分析中確定了與增強抗腫瘤免疫和對免疫治療反應相關的腸道微生物。而這些研究大多集中在腸道微生物，呼吸道微生物和肺癌的相關性研究鮮少被提及。同時，研究表明正常個體的下呼吸道通常含有普雷沃氏菌和韋氏菌等口腔細菌，作者在先前的研究已證明了以口腔共生菌富集為特征的呼吸道菌群失調與個體的肺部炎性加重有關，這樣的菌群失調可能觸發宿主轉錄組信號改變（PI3K和 MAPK）。

為了進一步探究呼吸道微生物在肺癌中的臨床意義，作者利用前瞻性人群隊列和小鼠模型來確定可能影響肺癌預后的呼吸道微生物菌群。

結果解讀

樣本收集

作者團隊在2013年3月至2018年10月間，從NYU Lung Cancer Biomarker Center招募了148名患有肺結節的受試者，這些患者都接受了臨床支氣管鏡檢查，作者從檢查中獲得了下呼吸道刷用來進行下一步研究，所有樣本均在患者接受治療前獲得。其中15例患者為非肺原發腫瘤(轉移)，12例患者為良性肺結節，38例患者為其他良性診斷而被排除未納入研究隊列，其余83名患者最終診斷為原發性肺癌，并被納入這項研究。 在這些患者中，均有16S測序數據，70例患者有轉錄組數據，40例患者有RECIST（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors）評估，75例患者有超過6個月的臨床隨訪數據，64例患者有超過12個月的臨床隨訪數據。樣本臨床信息見下表。

表1：研究隊列臨床信息表

肺癌進展相關微生物特征的挖掘

（1）不同部位樣本的菌群差異

除了下呼吸道刷外，作者還從患者的支氣管鏡檢查中獲得了上呼吸道刷（口腔部）和支氣管鏡檢查背景對照樣本，這些樣本被納入16S 測序分析從而一并比較。基于Bray-Curtis 相異度指數的PCoA分析表明，不同部位樣本的菌群β多樣性顯著不同（Figure 1a, PERMANOVA, p<0.001）。而在下呼吸道樣本中，小細胞肺癌（SC）和非小細胞肺癌（NSCLC）的菌群β多樣性也顯著不同（PERMANOVA, p=0.01）。

（2）基于NSCLC臨床TNM分期分類樣本的菌群差異

在NSCLC樣本中，作者根據臨床TNM分期，同時基于以往的預后/生存數據和與NSCLC手術治療相關的癌癥管理指南，將樣本分為I-IIIA和IIIB-IV這兩組。PCoA分析表明，這兩組樣本的菌群β多樣性存在顯著差異（Figure 1b, PERMANOVA, p=0.005）。相比于I-IIIA組，IIIB-IV組的呼吸道樣本菌群構成更接近口腔樣本的菌群構成（Figure 1b, Bray Curtis Distance, p<0.0001）。同時作者也比較了各個分期（I-IV）樣本的菌群特征，結果表明，越晚期的病人樣本，其呼吸道樣本的菌群構成越接近于口腔樣本的菌群構成。而MiRKAT分析表明，NSCLC I-IIIA組和IIIB-IV組之間的微生物群落分布差異并非由于樣本位置的不同引起。

（3）不同PD-L1表達的病人樣本的菌群差異

作者在腫瘤PD-L1表達值可獲得的部分病人（n=39）中研究發現，相比于低表達PD-L1的病人（0%, n=16 和 1–79%, n= 11），高表達PD-L1的病人（(≥80%, n=12）其呼吸道樣本的菌群構成更接近口腔樣本的菌群構成(Supplementary Figure 5, Bray Curtis Distance, p<0.05)。

（4）不同生存率病人樣本的菌群差異

PCoA分析確定了基于6個月和12個月生存率的病人樣本，菌群成分具有顯著差異(Figure 1c, PERMANOVA, p<0.05)，其中，與預后較好的病人相比，存活率較低的病人樣本的菌群構成更接近口腔樣本的菌群構成（Figure 1c, Bray Curtis Distance, p<0.0001）。而多元PERMANOVA分析表明，不同生存率病人其呼吸道菌群的差異與TNM分期無關。

（1）（2）（3）（4）結果初步表明，不同分組肺癌病人的呼吸道菌群存在顯著差異，惡性程度越高的病人，其呼吸道菌群擁有越多的口腔共生菌。

（5）肺癌進展相關OTUs挖掘

作者在前面研究中，已初步探究到肺癌不同進展病人的呼吸道菌群構成存在差異，作者在接下來的研究中運用DESeq分析進一步尋找具體的差異OTUs（I-IIIA vs. IIIB-IV groups of NSCLC）。

基于矯正樣本來源部位因素影響的混合效應模型，作者探究在NSCLC 中I-IIIA組和IIIB-IV組間豐度差異的top20 OTUs（根據絕對系數排序），結果表明，IIIB-IV組病人下呼吸道顯著富集了在先前研究中被認為是口腔共生菌的OTUs，如嗜血桿菌屬，梭桿菌屬，孿生球菌屬，普雷沃氏菌屬和顆粒鏈菌屬等（Supplementary Table 3）。而在I-IIIA組和IIIB-IV組內研究中，生存率較差的樣本相比于生存率較好的樣本，韋榮氏球菌屬，普雷沃氏菌屬和顆粒鏈菌屬等顯著增加（Supplementary Figure 9a–d, Supplementary File Table 2–5）。進一步的研究中，作者基于矯正樣本來源病人的吸煙狀態，TNM分期，以及治療類型等因素影響的混合效應模型，確定了與肺癌總生存率相關的top20 OTUs，結果表明肺癌的不良預后與普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬和孿生球菌屬等口腔共生菌在下呼吸道的富集高度相關（Supplementary Table 4）。

而基于狄利克雷多項式模型（Dirichlet Multinomial Model, DMM），作者確定了樣本可分為兩類：第一類由所有上呼吸道樣本和60%的下呼吸道樣本組成，第二類由所有支氣管鏡背景對照樣本和40%的下呼吸道樣本組成。 與上呼吸道樣本聚為一起的下呼吸道樣本（60%）主要富集了韋榮氏球菌屬、鏈球菌屬、普雷沃氏菌屬和嗜血桿菌屬等，作者將這些菌群定義為SPT（supraglottic predominant taxa）。而與支氣管鏡背景對照樣本聚為一起的下呼吸道樣本（40%）則主要富集了黃桿菌屬和假單胞菌屬等，作者將這類菌群定義為BPT（background predominant taxa）（Supplementary Figure 12）。 與I-IIIA期NSCLC患者相比，IIIB-IV期NSCLC患者下呼吸道樣本中被歸類為富集SPT的樣本占比更高(Figure 1d, p=0.006)。 而Kaplan-Meier生存分析顯示，在I-IIIA期NSCLC患者中，SPT型比BPT型生存期更差(Figure 1e, p=0.047)，在IIIB-IV期NSCLC患者中，SPT型和BPT型的生存在統計學上沒有差異。進一步的，作者在IIIB-IV期NSCLC患者中評估菌群與臨床RECIST打分的相關性，在這部分病人中，上呼吸道和下呼吸道樣本間的Bray-Curtis 相異度指數和RECIST打分呈顯著負相關（Spearman r = ?0.48, p=0.03）。因此，盡管這部分病人的總生存率與SPT型和BPT型分類無關，但該結果依然證明了RECIST評分為陽性（腫瘤進展）與下呼吸道的菌群構成更接近于上呼吸道的菌群構成有關，RECIST評分為陽性的病人下呼吸道中富集了更多的SPT（Supplementary Figure 14）。

作者在這部分結果中，進一步確認了與肺癌進展相關的OTUs，并將其定義為SPT（supraglottic predominant taxa）和BPT（background predominant taxa）。

Figure 1. Lung microbiota in lung cancer and cancer survival.

與SPT和BPT相關的轉錄組特征

作者從70例NSCLC患者的下呼吸道樣本中獲得了RNA-seq數據。不同于微生物特征，I-IIIA組和IIIB-IV組間的Bray-Curtis 相異度指數在統計學上并沒有差異，DESeq分析僅在兩組間找到20個差異表達基因，同樣的，在不同生存率病人間，也僅有很少的差異表達基因被找到（Supplementary File Table 8）。

不同于尋常的分期分組，在基于SPT和BPT分型的樣本分組中，更多的差異表達基因被挖掘（Figure 2a, FDR<0.25）。對這些差異基因進行功能富集發現，SPT與p53突變、PI3K/PTEN、ERK和IL-6/IL-8等典型通路的上調有關。

作者在這部分結果中，發現SPT和BPT可引起宿主轉錄組信號改變

多組學分析

為了更好的探究肺癌中宿主/微生物相互作用，作者運用了一個多組學分析框架（共現概率網絡），以此來評估菌群與宿主的轉錄組特征共現的概率，同時用MMvec計算菌群出現在I-IIIA進展期和 IIIB-IV進展期的概率大小，并將其添加進網絡中（Figure 2c），最后作者運用decontam軟件包去除噪聲，最終確認了韋榮氏球菌屬（OTU#585419）為與肺癌進展最相關的OTUs，其還與細胞粘附分子、IL-17、細胞因子和生長因子、趨化因子信號通路、TNF、Jak-STAT、PI3K-Akt信號通路高度相關（Supplementary File Table 10）。基于BLAST，該OTUs最終被比對注釋為Veillonella parvula。

作者在這部分結果中，最終確認了Veillonella parvula為呼吸道菌群中與肺癌進展最相關的菌

Figure 2. Airway transcriptome in NSCLC lung cancer based on lung microbiota.

呼吸道生態失調小鼠模型

作者在肺癌小鼠模型中驗證由Veillonella parvula引起的下呼吸道生態失調對肺癌進展的影響（KP模型小鼠，Figure 3a）。結果表明，Veillonella parvula引起的下呼吸道生態失調對野生型小鼠的生存和體重不影響，而Veillonella parvula引起的下呼吸道生態失調導致KP模型肺癌小鼠生存期減少，體重降低，腫瘤負荷增加（Figure 3a, 3b, Supplementary Figure 18a,b）。

同時作者在生態失調誘導后第3周做了重復實驗，通過轉錄組數據、基于FACS的T細胞譜數據和細胞因子測量數據來評估模型對生態失調的免疫反應：Ⅰ、轉錄組數據的PCoA分析結果顯示，四種實驗條件之間（WT, Dys, LC, LC+Dys）存在明顯差異，其中LC+Dys組的轉錄組特征變化比LC組更大（Supplementary Figure 19a）。Ⅱ、基于CIBERSORT的腫瘤免疫微環境分析，明確了下呼吸道生態失調導致Th1細胞增加和樹突狀細胞激活（Supplementary Figure 19b）。Ⅲ、IPA分析結果顯示，下呼吸道生態失調也導致了PI3k/Akt，ERK/MAPK，IL-17A，IL-6/IL-8和炎癥小體信號通路的上調（Figure 3c）。

作者在比較小鼠模型中下呼吸氣道生態失調誘導的轉錄組信號與SPT型NSCLC病人中識別的轉錄組信號時，發現IL-17信號、趨化因子、TOLL樣受體、PD-L1信號和PI3K-Akt信號等相關的轉錄組特征信號變化是一致的。最終，作者得出結論，Veillonella parvula引起的下呼吸道生態失調導致Th17細胞增多，IL-17水平升高，PD-1⁺ T細胞表達增加，中性粒細胞增多（Figure 3e, Supplementary Figure 22a）。而CD4+、CD8+和中性粒細胞的免疫組化結果表明，這些炎性細胞的增加主要發生在沒有腫瘤侵襲的肺組織中（Figure 3e）。

Figure 3. Pre-clinical model of lung dysbiosis in lung cancer and cancer survival.

為了進一步評估失調誘導的IL-17激活在肺癌進展中的重要性，在KP小鼠模型腫瘤發生后用抗IL-17單克隆抗體和同型對照抗體治療小鼠兩周（Figure 4a）。結果表明，和對照組相比，抗IL-17單抗治療后的小鼠腫瘤負荷明顯降低（p=0.0059, Figure 4b）。免疫微環境分析表明，抗IL-17單抗治療后的小鼠，RORγt⁺ CD4⁺ T細胞和中性粒細胞表達明顯降低，免疫組化結果表明，這些炎性細胞的減少發生在在沒有腫瘤侵襲的肺組織中，而并非發生在肺癌組織中（Figure 4c, 4d）。

Figure 4. IL-17 blockade during lung dysbiosis in lung cancer preclinical model.

作者在這部分結果中，驗證了Veillonella parvula引起的下呼吸道生態失調可促進肺癌腫瘤炎癥微環境，表現為Th17 細胞增多，激活具有潛在抗原呈遞能力的樹突細胞，以及癌旁組織中檢查點抑制劑標記物的增加。

小編總結

在這項研究中，作者首次提出并證實了肺癌患者下呼吸道菌群的失調將會改變宿主的轉錄組信號通路以及促進腫瘤炎癥微環境，從而影響肺癌發生發展和病人預后。在通篇研讀完這篇文章后，小編不禁感慨這篇高分文章工作量之大，細節處理之妙，上下文結構遙相呼應，干濕結合，邏輯通暢，建議大家下載原文來研讀學習！