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細胞死亡的方式一直以來都是生物醫學領域的研究熱點，關于細胞凋亡、細胞自噬、細胞壞死已經有了大量作者進行研究了，其中鐵死亡無疑是近年來生物科學領域TOP 10熱點前沿，且相關研究多次產出高分文章。鐵死亡是一種鐵依賴的脂質過氧化引發的新型細胞死亡方式，更重要的是，鐵死亡被發現其在腫瘤細胞中發生，并且在癌癥免疫中發揮作用，這意味著鐵死亡還能與目前最熱門的癌癥治療—免疫治療攀上關系，兩大熱點相互碰撞，很難不火！下面就讓跟著小編一起解讀一篇刊登在Cell Metabolism (IF=27.287) 上的文章吧。
一、研究背景
目前免疫治療主要包括免疫檢查點抑制劑、雙特異性抗體、抗體藥物偶聯物（ADC）、CAR-T治療四大類型，都依賴于強效抗腫瘤T細胞對癌細胞的靶向破壞。其中，利用免疫檢查點抑制劑(ICB)增強內源性抗腫瘤反應和通過過繼細胞治療給藥特異性抗腫瘤免疫細胞的癌癥免疫治療在治療多種惡性腫瘤方面取得了前所未有的成功。但是其中一個主要問題是CD8+ T細胞在遇到免疫抑制腫瘤微環境(TME)時功能失調。
TME中有多種免疫細胞浸潤, 其中CD8+ T細胞由于具有殺傷細胞內病原體和腫瘤細胞等細胞毒性能力，通過調節CD8+T 細胞的代謝，恢復和增強腫瘤環境中異常的CD8+T 細胞的功能是免疫治療中的一個熱點研究對象。
該研究揭示了CD36調節CD8+效應T細胞功能的新機制，以及靶向CD36或抑制鐵死亡恢復T細胞功能的治療潛力。
二、結果
1、在人類癌癥中，腫瘤浸潤性CD8+ T細胞的CD36表達與腫瘤進展和低生存率相關
作者使用 獨創性通路分析（IPA）對黑色素瘤患者的CD8+T細胞進行分析時，發現來自長期存活患者的腫瘤浸潤性 CD8+ T細胞顯著上調了 LXR /RXR 和 PPARa/RXRa 以及下調 TREM1 信號通路（圖1A），在這些信號通路下游分子CD36 被下調。此外，通過RNA-seq數據進行分析，與無反應者相比，對 PD-1 有反應的患者表現出最顯著的 LXR/RXR 激活信號通路上調，并且 CD36 在該通路中被下調，故CD36 表達與患者預后之間呈負相關。
進一步分析黑色素瘤患者的CD8+T細胞中脂質代謝相關基因的表達發現，發現在存活周期長的病人中，CD8+T細胞的CD36表達更低。（圖1B）。與來自MM（多發性骨髓瘤） 患者的細胞相比，來自MGUS (單克隆丙種球蛋白病) 患者的CD8+ T 細胞的 CD36 表達較低（圖1C）。MM 患者的骨髓（腫瘤床）和外周血相比，骨髓中的 CD8+ T 細胞比外周血中的 CD8+ T 細胞有更高的 CD36 表達（圖1D）。
綜上所述，由腫瘤浸潤性 CD8+ T 細胞中 CD36 表達的增加與人類腫瘤進展和低生存率有關。
2、腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞上的 CD36 表達隨著腫瘤進展而上調，而CD36 缺乏導致小鼠癌癥中更好的抗腫瘤反應。
為了確定CD36 在腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞上的表達和作用，作者使用小鼠黑色素瘤（B16）和小鼠 MM 構建 Vk*MYC 模型。研究發現腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞上的 CD36 表達隨著B16 腫瘤的體積的增大及Vk*MYC 腫瘤中M-spike條帶強度的增加而上調（圖1E-F），而不同時間點 CD4+ T 細胞上 CD36 的表達沒有變化。結果表明，在小鼠腫瘤模型中，腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞上的 CD36 表達與腫瘤進展呈正相關。
先前的研究表明，TME中的膽固醇誘導CD8+ T細胞功能衰竭，抑制膽固醇代謝可增強CD8+ T細胞抗腫瘤功能，因此為了確定 TME 中的膽固醇是否導致腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞中 CD36 表達的上調，如果是，那么CD8+ T 細胞上的 CD36 表達是否影響其抗腫瘤功能。作者使用 bCD（β-環糊精）來消耗 TME 中的膽固醇，發現膽固醇直接誘導 CD8+ T 細胞上的 CD36 表達（圖 1H），其次，與野生型 (WT)小鼠相比，CD36 缺陷型 (CD36-/-)小鼠中 B16 腫瘤的生長速度較慢，并且荷瘤 CD36-/- 小鼠的存活時間比 WT 小鼠長。然而，當這些小鼠中的 CD8+ T 細胞耗竭時，兩種小鼠之間腫瘤生長和小鼠存活率差異就消失了。
綜上所述，TME 中的膽固醇誘導CD8+ T 細胞上的 CD36 表達隨著腫瘤進展而上調，且影響CD8+T細胞的抗腫瘤作用。
3、在人和小鼠CD8+ T細胞中，CD36的表達與細胞毒性細胞因子的產生減少和抗腫瘤活性受損有關
由于CD8+ T 細胞上的 CD36 表達與抗腫瘤功能減弱和預后不良有關，故作者探究了CD8+ T 細胞中 CD36 與細胞毒性細胞因子相關基因表達之間的關系，結果表明，CD36 在CD8+ T 細胞上的表達與許多細胞毒性細胞因子相關基因的表達及其轉錄因子（如 IFNG、PRF1、GZMB 和 TBX21）呈負相關（圖 2A）。
其次，2周皮下(s.c)生長的B16腫瘤中CD8+ T細胞與1周腫瘤T細胞相比具有更低的IFNγ和TNFα產量(圖2B)。由此作者進一步檢查了來自皮下的 T 細胞 IFNγ 和 TNFα 的產生，發現與來自 WT 小鼠的 T 細胞相比，來自 CD36-/- 小鼠的腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞具有更高的 IFNγ 和 TNFα 產量以及更高的增殖率（圖 2C），表明腫瘤內 CD8+ T 細胞攜帶 CD36-/- 的小鼠比WT 小鼠具有更強的效應功能。
緊接著，作者想探究CD36缺乏是否也會影響CD4+ T細胞功能。因此作者檢測到CD4+ T細胞中IFNγ、TNFα、Gzmb和穿孔素的產生，發現IFNγ和TNFα的增加及Gzmb和穿孔素的產生與腫瘤浸潤的CD4+ T細胞沒有顯著性影響，故CD36缺乏主要影響CD8+效應細胞功能，而非CD4+效應細胞功能。
為了證實上述結果，作者對B16肺轉移瘤模型及Vk*MYC模型中的T細胞進行了研究。結果表明，來自CD36-/- 小鼠的肺(腫瘤床)、脾臟、引流淋巴結和淋巴結的CD8+ T細胞與對照小鼠相同器官的T細胞相比有更高的IFNγ和TNFα生成(圖2F-2H)。并且與對照小鼠相比，CD36-/-小鼠的腫瘤灶更少(圖2I)。這些結果表明，CD8+ T細胞表達CD36可抑制其細胞毒性細胞因子的產生，抑制其抗腫瘤功能。
更進一步，作者將腫瘤特異性T細胞轉移到B16肺轉移和皮下生長的B16腫瘤模型中。與Pmel-1 WT CD8+ T細胞相比，過繼轉移Pmel-1 CD36-/-CD8+ T細胞在B16荷瘤小鼠肺、脾臟和淋巴結中有更高的IFNγ和TNFα生成，且具有更好的抗腫瘤功能和延長小鼠生存期。
綜上所述 ，CD36會影響CD8+T細胞分泌殺傷性的細胞因子，從而影響CD8+T細胞的抗腫瘤作用。
4、CD36 表達與小鼠和人腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞中脂質過氧化和鐵死亡的激活有關
為了闡明 CD36 介導的 CD8+T 細胞中細胞毒性細胞因子產生抑制的機制，作者分析了來自 WT 和 CD36-/- 小鼠的內源性肺轉移 B16 腫瘤浸潤 CD8+T 細胞的 RNA-seq 數據，分析結果表明sirtuin 途徑被激活，氧化磷酸化途徑被下調（圖 3A）。使用對代謝相關通路的通路富集分析（圖 3B）時發現，與 WT CD8+ T 細胞相比，CD36-/- CD8+ T 細胞可能具有更低的氧化應激、更少的 ROS 產生和更少的氧化應激誘導的細胞死亡。
脂質過氧化是脂質受到氧化劑攻擊的過程，可以由氧化應激和 ROS 誘導，而鐵死亡是一種由脂質過氧化引起的細胞死亡。基于上述多途徑分析的結果，作者推測 CD36-/- CD8+ T 細胞可能比 WT CD8+ T 細胞具有更低的脂質過氧化，并假設 CD36-/- CD8+ T 細胞的鐵死亡水平低于 WT CD8+ T 細胞。通過RNA-seq 數據分析和富集分析（圖 3C-D）得出，CD36的表達與脂質過氧化和鐵死亡密切相關，且CD36-/- CD8+ T 細胞與脂質過氧化或鐵死亡激活相關的基因表達較低且在腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞中的富集較少。
為了證實CD36 表達會誘導CD8+ T 細胞中脂質過氧化和鐵死亡的激活的臨床相關性，作者進行了以下分析（圖3E-K）：
首先，對黑色素瘤患者腫瘤浸潤性 CD8+ T 細胞進行單細胞測序數據和基因表達富集分析，發現患者腫瘤浸潤性 CD36 表達高的CD8+ T 細胞對參與細胞對 ROS 和氧化應激反應的信號通路有更高的激活，且具有與更高水平的脂質過氧化和鐵死亡以及降低的細胞毒性功能相關的基因表達模式。
緊接著，使用脂質過氧化檢測試劑盒和細胞死亡率來評估細胞中鐵死亡的水平，發現來自 CD36-/- 小鼠的腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞脂質過氧化、細胞死亡率、鐵水平及細胞溶質 ROS 水平均比WT小鼠低。過繼轉移的肺和皮下生長的 B16 腫瘤模型的腫瘤浸潤 Pmel-1 CD36-/- CD8+ T 細胞相比于Pmel-1 WT CD8+ T也有同樣的結果。
5、CD36 介導的鐵死亡是導致小鼠和人 CD8+ T 細胞中細胞毒性細胞因子產生減少的原因
為了確定 CD36 介導的鐵死亡是否導致CD8+T 細胞中細胞毒性細胞因子的產生減少，作者做了如下工作：
首先分析了皮下生長的 B16 腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞的脂質過氧化。將腫瘤浸潤的 CD8+ T 細胞分為 CD36high 和 CD36low 群體，并觀察到腫瘤浸潤的 CD36high CD8+ T 細胞比 CD36low CD8+ T 細胞具有更高的脂質過氧化和鐵死亡（圖4A-B）。
其次，分析了 1 周和 2 周皮下生長的 B16 腫瘤的腫瘤浸潤的 CD8+ T 細胞，并發現與來自 1 周腫瘤的 T 細胞相比，具有高 CD36 表達的 2 周腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞具有顯著更高的脂質過氧化和鐵死亡（圖4C-D）。此外，與脾臟 CD8+T 細胞相比，B16 腫瘤浸潤 CD8+T 細胞具有更高水平的 CD36 表達、脂質過氧化、細胞死亡、鐵死亡和細胞溶質 ROS（圖 4E-4G）。
這些結果表明 CD8+ T 細胞上的 CD36 表達與其在 TME 中的鐵死亡誘導呈正相關。
緊接著，在存在腫瘤的情況下培養 CD8+ T 細胞顯著上調 CD36 表達并誘導脂質過氧化并抑制 T 細胞中的 IFNγ 和 TNFα 產生（圖4H-J），使用 CD36-/- CD8+ T 細胞來進一步確定 CD36 在腫瘤誘導的脂質過氧化、鐵死亡以及 CD8+ T 細胞中 IFNγ 和 TNFα 生成減少中的作用。與腫瘤治療的 WT CD8+ T 細胞相比，腫瘤治療的 CD36-/- CD8+ T 細胞具有更低的鐵死亡水平和更高的 IFNγ 和 TNFα 產量（圖4K-M），表明 CD8+ T 細胞的 CD36表達 負責誘導腫瘤的脂質過氧化、鐵死亡，并導致細胞毒性細胞因子的產生減少。
此外，研究表明，添加鐵死亡抑制劑 (ferrostatin-1) 可部分消除腫瘤誘導的鐵死亡并恢復細胞中 IFNγ 和 TNFα 的產生，表明 CD36 介導的鐵死亡抑制 CD8+ T 細胞毒性細胞因子產生。從 Vk*MYC 腫瘤模型和 MM 患者中獲得了類似的結果（圖4N-R）。
最后，為了進一步確定這些發現是否與人類癌癥相關（圖4T-V），作者添加MM患者骨髓血漿的人CD8+ T細胞培養顯著上調CD36表達，并誘導脂質過氧化和鐵死亡以抑制T細胞中細胞毒性細胞因子的產生。此外，CD36 阻斷抗體或添加鐵死亡抑制劑 (ferrostatin-1) 可部分消除腫瘤誘導的鐵死亡并恢復細胞。
6、CD36 介導鐵死亡并通過小鼠和人類 CD8+ T 細胞中的脂肪酸攝取減少細胞毒性細胞因子的產生
為了闡明 CD8+ T 細胞中 CD36 介導的鐵死亡的潛在機制，在皮下生長或肺轉移的 B16 腫瘤模型中，發現腫瘤組織的脂肪酸含量高于正常皮膚或脾臟，轉移的肺組織的脂肪酸含量高于正常肺。在 Vk*MYC 腫瘤模型中，與正常骨髓相比，攜帶 MM 的骨髓具有更高的脂肪酸含量（圖5A-C）。
由于鐵死亡主要是由于細胞內的脂質過氧化物的堆積引起的，及 CD36可通過攝取腫瘤環境中的脂肪酸，因此作者推測通過 CD36 攝取脂肪酸會誘導 CD8+ T 細胞鐵死亡，導致細胞毒性細胞因子產生減少。為了驗證這一假設，其進一步研究了脂肪酸混合物對 CD8+ T 細胞鐵死亡和細胞毒性細胞因子產生的影響（圖5D-J），發現脂肪酸誘導的 CD8+ T 細胞鐵死亡。鐵死亡誘導劑（RSL-3 和 Fin56）用作陽性對照，并顯著誘導 CD8+ T 細胞鐵死亡。脂肪酸、RSL-3 和 Fin56 均顯著抑制 CD8+ T 細胞毒性細胞因子的產生。添加鐵死亡抑制劑 ferrostatin-1、SRS16-86 或 liproxstatin-1 可挽救脂肪酸誘導的鐵死亡，并恢復 T 細胞中 IFNγ 和 TNFα 的產生。在人類 CD8+ T 細胞中也觀察到了類似的現象。
其次，我們檢查了 CD36 在 CD8+ T 細胞脂肪酸攝取、鐵死亡激活和細胞毒性細胞因子產生中的作用。我們觀察到（圖5N-T），與 WT CD8+ T 細胞相比，CD36-/- CD8+ T 細胞的脂肪酸攝取較少，并表現出較少的鐵死亡并產生更多的 IFNγ 和 TNFα。
這些結果證實了上述假設，即腫瘤組織富含脂肪酸，并且脂肪酸誘導 CD8+ T 細胞鐵死亡和效應子功能的喪失。
此外，作者分析了腫瘤處理的 CD36-/- CD8+ T 細胞和 WT CD8+ T 細胞中的脂肪酸組成。結果表明，只有 AA（u-6 多不飽和脂肪酸的代表） 在 WT CD8+ T 細胞中誘導脂質過氧化和鐵死亡、細胞溶質 ROS 水平的增加，并減少細胞毒性細胞因子的產生，但在 CD36-/- CD8+ T 細胞中不誘導。
綜上所述， CD36通過攝取腫瘤環境中的脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪-花生四烯酸，導致了CD8+T細胞內脂質過氧化物的堆積，鐵離子含量升高，鐵死亡過程增多，殺傷性的細胞因子分泌減少。
7、靶向鐵死亡或 CD36 增強 CD8+ T 細胞和基于 ICB 的腫瘤免疫治療
為了研究 CD8+ T 細胞中鐵死亡的水平是否影響其抗腫瘤功能，作者比較了對照、鐵死亡誘導劑 RSL-3-、脂肪酸或鐵死亡抑制劑 ferrostatin-1 處理的荷瘤小鼠 CD8+ T 細胞的抗腫瘤作用。
結果表明，過繼轉移后，小鼠外周血檢測到的CD8+ T細胞的數量的關系為ferrostatin-1 > 對照組 > 鐵死亡誘導劑 RSL-3-、脂肪酸。同樣的，注入 ferrostatin-1 處理的 CD8+ T 細胞的小鼠在所有組中顯示出更低的鐵死亡和更高的 IFNγ 產生和增殖，以及最小的腫瘤負荷和最佳的存活率，而脂肪酸或 RSL-3 處理的 CD8+ T 細胞在小鼠中發揮受損的抗腫瘤作用。 此外，為了進一步確定臨床治療效果，當 CD36-/- CD8+ T 細胞與抗 PD-1 抗體結合進行聯合免疫治療，能獲得了更好的抗腫瘤效果并延長了小鼠存活時間或單獨的 PD-1 抗體。
綜上所述，通過阻斷CD36的表達，或者添加鐵死亡的抑制劑，可以顯著減少CD8+T細胞內脂質過氧化物的含量，增加殺傷性分泌分子的表達，可以顯著延長CD8+T細胞在體內的存活時間，增強體內抗腫瘤功能，即通過阻斷 CD8+ T 細胞上的 CD36 可增強基于 ICB 的免疫療法。
四、討論
這篇鐵死亡+免疫治療的套路總結如下：
首先，探究在腫瘤進展中與CD8+ T細胞相關的表達與作用，進而得出TME 中的膽固醇誘導CD8+ T 細胞上的 CD36 表達升高與腫瘤進展和低存活率呈正相關。進一步研究得出CD36會影響CD8+T細胞分泌殺傷性的細胞因子，從而影響CD8+T細胞的抗腫瘤作用。
緊接著，探索CD36如何調節CD8+T細胞功能的機制研究，得出CD36的表達與脂質過氧化和鐵死亡密切相關。
進而確定 CD36 介導的鐵死亡是否導致CD8+T 細胞中細胞毒性細胞因子的產生減少，如果是，則其抑制的機制是什么？得出CD36通過攝取腫瘤環境中的脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪-花生四烯酸，導致了CD8+T細胞內脂質過氧化物的堆積，鐵離子含量升高，鐵死亡過程增多，細胞毒性細胞因子分泌減少。
最后，為了進一步貼合臨床治療效果，研究人員對黑色素瘤負荷小鼠進行免疫治療。結果表明通過外源輸入CD36缺失的CD8+T 細胞， 結合PD1的聯合免疫治療，顯著增強了CD8+T細胞的抗腫瘤作用。
