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研究背景
缺氧基因：缺氧相關基因被定義為在低氧水平反應中被上調的基因。腫瘤微環境與缺氧一直是許多關注的話題，大到CNS系列小到一些水刊，而在生信方面的研究目前仍然還是有很大潛力。
熱門的原因：腫瘤內部營養供給和需求的不平衡往往會導致缺氧、葡萄糖缺乏，從而形成酸性腫瘤微環境。在缺氧環境下，腫瘤細胞可以利用免疫逃逸機制來驅動轉移和侵襲,缺氧可降低腫瘤微環境中各種免疫細胞的活性，減少相應免疫刺激因子的產生，增加抑制因子的釋放和免疫檢查點抑制劑的表達。因此這方面的研究也往往與免疫相互結合起來。
缺氧基因前景：小王就以在Pubmed以“hypoxia[Title/Abstract] AND tcga[Title/Abstract]”進行搜索，先看看缺氧相關研究，結果顯示：
年份 | 已發表文章數目 |
2018年 | 20 |
2019年 | 39 |
2020年 | 64 |
2021年（截止2021年8月10日） | 73 |
缺氧基因相關的研究仍然在增長，這方向潛力依然很大。今天小王講的今年五月份發表的缺氧基因預后模型的相關生信研究，并對文章的難度進行打分，滿分難度是5顆星。
Identifcation and validation of a hypoxia-related prognostic and immune microenvironment signature in bladder cancer（IF：5.72，Journal: Cancer Cell International）
論文難度：※ ※ ※
首先對該文的整體框架簡單說一下：
這篇文章都是通過TCGA數據庫構建如下的模型：
然后驗證模型的準確性，再對免疫抑制微環境以及免疫浸潤情況進行分析,最后是外部實驗驗證。
展開來講：
背景知識：（1）膀胱癌預后差（2）缺氧在膀胱癌發展和免疫逃逸中發揮了作用
研究方法與結果
作者的整體思路見下圖
STEP 1 （構建模型）
1. 獲取基因
作者獲取缺氧相關基因集取自GSEA (hallmark-hypoxia)——TCGA下載患者相關的臨床信息以及轉錄組數據。獲取基因集是根據相關的基因縮小了方位。
2. 篩選基因
（1）構建PPI網絡，可以根據節點數確定膀胱腫瘤中比較重要的缺氧基因（圖2 a-b），作者確定了排名節點數為前50 的基因。
（2）單因素Cox分析，確定了這些基因的預后價值（圖2 c），最終確定了14個基因與免疫有關。這樣，構建模型的原材料就有了。
（3）利用多因素Cox分析，作者以這14個基因為模板構建模型，模型的計算公式就是文章開頭說的公式，模型基因在多因素Cox的結果也在圖2 d中。
STEP 2（模型驗證）
1. GEO數據庫驗證
作者得到模型后，利用GEO數據庫進行了驗證。患者根據風險值Risk的中位值分為高低風險組，首先是對模型基因的展示，在高低風險組的基因表達情況——模型基因熱圖（圖3a），接下來是患者們預后情況的展示風險曲線圖（圖3b）、風險散點圖（圖3c）、風險死亡比例圖（圖3d），最后是高低風險組患者們的生存有無統計學差異通過K-M生存分析展示（圖3e）。從這些圖，不難看出，高風險組患者們的預后明顯要比低風險組的差。
2. 對模型的可靠性驗證
首先作者通過ROC曲線在兩個數據庫進行驗證，圖4a-b 是通過ROC曲線對模型驗證，其實兩個數據的模型的ROC值不是很高，甚至GEO數據庫的還沒有到0.7（但是絲毫沒有影響發表）；圖4c-d 單因素Cox分析了預后價值，兩個數據庫中都證實了模型預后價值；e-f: 多因素Cox分析RiskScore與臨床特征，也證實了其獨立預后價值，兩個圖中的P均<0.05,證實了模型的獨立預后價值。
3.不同臨床特征之間中高低風險組的預后
作者根據患者的不同特征，對高低風險的情況進行驗證，這個方面的驗證確實比較少見一些。
圖5中患者根據年齡、性別，Stage分期、T分期、N分期劃分成不同的組，再探討了高低風險組的生存是否有差異，結果也都顯示出，高低風險組的生存均有差異也再次證實了這個模型對預后的預測是有價值的。
STEP 3 免疫浸潤
作者為了了解模型與免疫微環境之間的關系，使用CIBERSORT分析了高低風險組22種免疫細胞的浸潤情況，患者免疫細胞群如圖6a，高風險組患者中靜息肥大細胞(P=0.023)，中性粒細胞（P=0.0061），未活化的CD4記憶T細胞（P=0.0023）（b-d）明顯富集，低風險組中低缺氧危險患者濾泡輔助性T細胞(p=0.011)、CD8 T細胞(p=0.0032)和漿細胞(p=0.0077)的比例更高（e-g）。
STEP 4 功能分析
作者在TCGA和GEO數據庫中對模型基因進行GSEA分析結果顯示：缺氧、上皮間質轉化、炎癥反應和補體等信號通路在高危組顯著富集 圖7。
STEP5 免疫抑制微環境（本期的重點）
為什么研究這個？
免疫抑制微環境指的是在腫瘤微環境中起著抑制免疫功能的部分，包括抑制性細胞與細胞因子。在本研究中，作者研究的是癌癥-免疫周期：腫瘤抗原釋放——樹突狀細胞識別——淋巴結——T細胞活化——消除腫瘤細胞。任何一個環節出現問題都會打破整個腫瘤免疫循環過程。
作者是怎么做的？
負調節腫瘤免疫周期這些基因從追蹤腫瘤免疫表型網站(http://biocc.hrbmu.edu.cn/ TIP/index.jsp)獲得。分析了它們在高低風險組中的表達情況，結果也顯示在高風險組中，周期負調控富集的基因大多升高(圖8a)，說明高風險患者與免疫治療效果差相關。接下來又是高低風險組中，免疫檢查點抑制劑與RiskScore 之間的線性關系，高低風險組中這些檢查點是否有表達差異（圖b-e,分別對應PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3），最后是高低風險組中免疫抑制有關細胞因子的表達水平的差異圖8f。
STEP6 實驗驗證
1. Qrt-PCR 驗證
SLC2A3 、ALDOB、 FOXO3、 SDC4 、VEGFA 、EGFR 、GPC1是作者得到的模型基因。作者進一步做了外部實驗驗證，首先搜集了膀胱癌患者們的癌癥標本與癌旁標本，其次利用qRT-PCR分析是否存在差異，如圖9 a-g，SLC2A3，FOXO3, EGFR and GPC1存在差異。
2.GEPIA 數據庫驗證
圖9 h -k, 作者利用GEPIA 數據庫分析FOXO3、EGFR、GPC1的高表達以及VEGFA的低表達與膀胱癌患者預后不良相關。
3. 3.免疫組化驗證
作者從Human Protein Atlas（人類蛋白質圖譜）獲取免疫基因相關免疫組化的數據，而且他們也自己進行了免疫組化，最后發現只有EGFR和SLC2A3這兩個基因在正常組織與癌癥組織中有差異。
