單細胞分析如何研究細胞動態變化？

文章簡介：

這篇文章發表在期刊: Embo Reports，期刊在最近一年的影響因子: 8.807比上一年增加了 1.31。這篇文章用 snRNA-seq 和 scRNA-seq 數據，構建人脊髓不同發育時期的單細胞轉錄組圖譜，得到完整的神經元數據集，揭示了不同時期人脊髓神經細胞的發育時期特性和遺傳異質性；鑒定了不同發育時期轉錄組特征，同時揭示了不同發育時期神經元的構成變化。

背景知識：

脊髓是一種高度組織化的組織，由三種不同的神經細胞組成：神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。同時，脊髓是外周系統與大腦間信號傳遞的橋梁。脊髓背角介導著外周感受信號，而腹側對于運動功能的執行至關重要，同時也是低級反射的中樞。作為一種高度有序的中樞組織，脊髓由多種不同的細胞類型有序發育形成。雖然脊髓的發育在嚙齒類動物中已進行了一系列的研究，但對人類脊髓發育過程了解較少。
一些單細胞測序（scRNA-seq）研究脊髓發育已經在模型系統中進行；然而，由于這些研究大多集中于神經發生，膠質細胞發育的單細胞轉錄組學信息仍然缺乏，尤其是星形膠質細胞。膠質細胞是神經系統的中樞組成部分。最近的研究指出膠質細胞在發育和成熟中樞神經系統中的作用越來越廣泛。單細胞分析為人類膠質細胞的多樣性和發展提供更多的信息。此外，與模式脊椎動物相比，人類胚胎的妊娠期較長，神經發生和膠質發生的時間較長。這種延長的發育有利于分析神經細胞亞型及其在成熟過程中的過渡狀態。基于此，對發育中的人類脊髓進行了高通量單細胞核 RNA 測序（snRNA-seq）和單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）研究。

結果解讀：

• 人脊髓發育過程中的snRNA-seq和scRNA-seq

作者從GW7到GW23獲取了脊髓樣本。GW是從女性最后一次月經期的第一天開始測量的。對樣品進行snRNA-seq和/或scRNA-seq處理(Fig 1A )。通過UMAP將數據投射到二維，并基于差異表達基因(DEG)和基因本體論(GO)分析確定主要細胞類型。一共鑒定出八大類：神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、室管膜細胞(包括頂板和底板細胞)、神經前體細胞、小膠質細胞、腦膜細胞和血管細胞(Fig 1B )。

• 膠質細胞分化始于GW8左右，腦室區域特定化發生在GW10左右

神經干細胞具有增殖和分化為神經細胞和膠質細胞的能力。作者研究了個體樣本內的分化軌跡(Fig 1C)。在GW14后，NPC簇失去了與神經元群的聯系，但與星形膠質細胞和少突膠質細胞簇的聯系仍然存在。在GW22之后，大多數分裂的NPC傾向于與少突膠質細胞群相連(Fig 1C)。免疫熒光分析還顯示，RBFOX3陽性神經細胞是GW7脊髓的主要細胞類型。從GW10開始，GFAP陽性星形膠質細胞呈放射狀膠質細胞形態，這有助于膠質細胞遷移。脊髓在GW23左右達到成熟形態(Fig 1D)。總的來說，這些結果反映了膠質細胞群體在發育過程中的動態產生。

• 解析神經元發育情況

為了深入了解神經元的分化過程，作者對從GW7到GW11的基于NPC和神經細胞的神經元譜系進行了亞群分析。通過表達螺旋-環-螺旋和成對的盒轉錄因子如HES6、DLL1和PAX3來鑒定神經前體細胞。興奮性神經元(EXC)、抑制性神經元(INH)和運動神經元(MN)分別通過SLC17A6、GAD1和MNX1的表達來區分。熱圖可視化顯示了簇中排名前10位的差異基因(Fig 2A)。差異表達數據的GO富集分析表明，神經元前體細胞富集在翻譯、起始和膜靶向蛋白上，而未成熟背部神經元富集在神經元分化和突觸信號上(Fig 2B)。作者觀察到，有絲分裂神經元前體簇強烈表達了背側神經前體基因PAX3，而腹側基因NKX6-2在該人群中的表達較少。免疫組織化學染色證實GW7后腦室區背側充滿神經前體細胞(Fig 2C)。接下來，作者確定每個發育時間點每個細胞群體的相對比例，以估計發育趨勢(Fig 2D)。雖然在GW7有腹側神經元發育的跡象，但作者的數據表明背側神經元的發育是這一時期的主要事件(GW7-GW11)。對GW10 (Fig 2E)的分析還表明，神經元分化途徑富集到神經元轉錄調控因子，如POU4F1和TLX3。

• 膠質細胞發育和表達區域特異性EGFR的膠質細胞

為了評價神經細胞的多樣性并剖析其在人脊髓中的發育，作者整合了從GW7到GW23的神經細胞數據集。整合導致了神經細胞類型的細胞轉錄多樣性(Fig 3A和C)。作者發現星形膠質細胞(0、3、7和14群，包括早期發育階段的祖細胞)在GW20達到最高比例(33.5%)，少突膠質細胞(4、6、8和11群)從GW8開始增加，到GW23達到51% (Fig 3B)，DEGs的GO富集分析表明，第0簇富含神經前體細胞增殖和膠質細胞分化相關基因，第3簇富含軸突發生和神經元遷移相關基因，第7簇富含纖毛組裝和纖毛組織，第14簇富含膠質細胞發育和星形膠質細胞分化相關基因(Fig 3D)。

作者注意到第14和0簇是由所有妊娠階段(GW7-GW23)的細胞組成的，而第3和第7簇是由只有在GW11之后才出現的細胞組成的。這種細胞組成的差異表明：14和0簇含有膠質分化前出現的祖細胞。對來自GW7的14和0簇的GO富集分析表明，14簇富含與脊髓發育和神經元命運commitment (Fig 4A and B)。第0簇富含膠質細胞命運commitment基因(如DAAM2、FAM189A2和ID4)，并在GW7出現分化停滯狀態(Fig 4A and B)。因此，作者的結果表明，在GW7，第14簇細胞是神經祖細胞，而第0簇代表靜止的膠質前體細胞。進一步分析表明，第14簇的細胞在GW11之后逐漸獲得星形膠質細胞的表達譜。為了說明這一轉換過程，作者構建了一個顯示細胞狀態轉換過程的單細胞軌跡。男性標本從神經發生后期到膠質發生階段的細胞按發育階段形成連續的直線軌跡，代表了EGFR⁺膠質細胞的過渡過程(Fig 4C)。結果顯示，DLL1在GW18后表達下降，隨后保持在相對較低的水平。與此同時，在GW14之后，作者觀察到調節神經前體分化和新生神經元存活的MIAT表達的減少。星形膠質細胞相關基因FAM189A2、GFAP和AQP4的表達從神經發生晚期開始持續增加(GW11) (Figs 4D)。軌跡分析結果與綜合分析結果一致，表明EGFR⁺細胞簇(共表達EGFR、DLL1和HES6)主要與星形膠質細胞譜系有關。接下來，作者根據潛在的受體-配體對相互作用來預測不同類型神經細胞之間的細胞間通訊網絡。這一分析表明EGFR⁺細胞與其他類型的膠質細胞(即星形膠質細胞、室管膜細胞、NPC、OPC和少突膠質細胞)之間的相互作用是通過Delta-Notch配體受體和EGFR信號通路實現的(Fig 4E)。

為了進一步研究EGFR表達的細胞，作者對GW7到GW23的脊髓樣本進行了免疫染色。作者發現EGFR⁺細胞在GW7的豐度很低，但在GW11左右急劇增加。此外，隨著時間的推移，這些細胞的形態也發生了變化。作者還注意到EGFR⁺細胞的分布具有位置特異性(Fig 5A和B)。在GW11時，在腦室帶的背側和腹側都觀察到了大量的EGFR⁺細胞。背側EGFR⁺細胞具有典型的放射狀膠質細胞形態，包括從腹部區延伸到軟膜表面的單個細小突起，可以用GFAP進行雙重標記(Fig 5D)。同時，在腹側EGFR⁺細胞群中觀察到EGFR和OLIG2的共定位(Figs 6A and B)，與作者的測序數據一致。在GW11scRNA-seq數據中，EGFR⁺簇表現出明顯的表達模式：大多數EGFR⁺PAX3⁺細胞不表達OLIG2，而在PAX3陰性EGFR⁺細胞中檢測到OLIG2表達(Fig 5C)。作者觀察到表皮生長因子受體與星形膠質細胞系標記物SOX9的共表達和少突膠質細胞系標記物OLIG2。表明EGFR⁺膠質細胞是一種既可分化為星形膠質細胞又可分化為少突膠質細胞的過渡狀態(Fig 6C and D)。綜上所述，作者的研究結果表明，一群表達EGFR的過渡性膠質細胞起源于神經元前體細胞，并通過中間階段逐漸轉化為星形膠質細胞和少突膠質細胞系。這些細胞可以通過受體-配體的相互作用來調節膠質形成。值得注意的是，作者的結果表明，在發育過程中，表達EGFR的過渡性膠質細胞以位置特異性的方式分布，背側EGFR⁺細胞主要集中在背角區域。

全文小結：

總體而言，作者已經勾勒出人類脊髓神經發育的圖景，涵蓋了從神經元產生到星形膠質細胞和少突膠質細胞分化的時期。不同發育階段的神經細胞類型的轉錄組特征是在單細胞分辨率下定義的。作者的研究提供了對人類脊髓發育的基本見解，可能有助于實現細胞治療方法來治療脊髓疾病。

參考文獻：Zhang, Q., Wu, X., Fan, Y., Jiang, P., Zhao, Y., Yang, Y., . . . Dai, J. (2021). Single-cell analysis reveals dynamic changes of neural cells in developing human spinal cord. EMBO Rep, 22(11), e52728. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34605607. doi:10.15252/embr.202152728