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Molecular Subtypes Based on Genomic and Transcriptomic Features Correlate with the Responsiveness to Immune Checkpoint Inhibitors in Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma
轉移性透明細胞腎癌中基于基因組和轉錄組學特征的分子亞型與免疫檢查點抑制劑的應答率相關
一．研究背景
免疫檢查點抑制劑（ICIs），如程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）阻斷劑，已被證明是治療多種癌癥類型的有效藥物。盡管腎細胞癌（RCC）的腫瘤突變負荷較低，但它具有獨特的免疫學特征，包括高免疫浸潤分數和細胞毒性CD8+T細胞浸潤的增加。在這種情況下，最近的III期臨床試驗，如CheckMate 025、CheckMate 214和KEYNOTE 426，表明與酪氨酸激酶抑制劑相比，基于ICIs的方案顯著改善了患者的生存率，尤其是在晚期透明細胞癌（ccRCC）。盡管ICIs是目前治療轉移性ccRCC的標準治療方法，但在多個臨床試驗中，40–60%的患者仍然對ICIs具有內在的耐藥性。因此，識別能夠預測ICIs應答者或非應答者的生物標記物具有極其重要的意義。雖然PD-L1表達是預測不同類型惡性腫瘤對ICIs反應性的常規生物標記物，但ccRCC的數據存在異質性，PD-L1表達的預測價值尚不具有臨床實用性。與其他實體瘤相比，腫瘤突變負荷和新抗原負荷是ICIs治療的常用預測因子，但與晚期ccRCC對PD-1阻斷的臨床反應無關。此外，在接受抗PD-1治療的ccRCC患者中，根據CD8+T細胞浸潤模式，未發現生存差異。最近，幾項研究報告，在ccRCC中常見的PBAF復合基因PBRM1的功能喪失（LOF）突變與ICIs更好的臨床益處（CB）相關。在這種情況下，全面了解ICIs治療的ccRCC患者PBRM1突變的分子機制對于開發一種新的生物標記物以及幫助預測哪些患者最有可能從ICIs治療中獲益至關重要。
二．研究方法
在這里，該研究對ICIs治療的轉移性ccRCC患者進行了靶向測序（n=60）和轉錄組測序（WTS）（n=61）。通過整合CheckMate 025試驗的WTS數據，獲得了共177個樣本腫瘤的WTS數據，并最終確定了三種分子亞型，它們具有不同的分子表型和PBRM1突變頻率。亞型1和3中的患者在ICIs治療后表現出更差的反應和生存率，較低的PBRM1突變和較差的血管生成，但免疫功能豐富，細胞周期豐富。值得注意的是，亞型2中的患者在ICIs治療后表現出更好的反應和存活率，PBRM1突變和代謝程序豐富以及較低的耗竭免疫表型。對亞型2的進一步分析表明，GATM（甘氨酸氨基轉移酶）作為一種與PBRM1突變相關的新基因，并揭示了其在減少ccRCC腫瘤增殖和抑制ccRCC腫瘤遷移方面發揮關鍵作用。總之，研究發現經ICIs治療的轉移性ccRCC具有不同的基因組和轉錄組學特征。并且還發現，新基因GATM可能是一種潛在的ccRCC腫瘤抑制因子，可能與ICIs治療轉移性ccRCC的療效相關。
三．研究結果
1、ICIs治療的ccRCC患者的基因組改變特征
為了評估經ICIs治療的轉移性ccRCC（n=60）患者的基因組圖譜，該研究集中于靶向測序數據，以確定復發性突變基因，并發現17個復發性改變的基因。該隊列中最常見的改變基因是VHL（n=34,56.7%）、PBRM1（n=18,30.0%）、SETD2（n=16,26.7%）和BAP1（n=12,20.0%），它們通常與之前報道的ccRCC常見突變基因相似（圖1A）。接下來，當對臨床受益（CB）組和非臨床受益（NCB）組之間的基因特異性改變進行比較時，CB組中17個復發性改變基因中只有PBRM1突變顯著富集（圖1B）。正如所料，與PBRM1野生型患者相比，PBRM1突變患者的總生存期（OS）顯著延長（圖1C）。
2. ICIs治療的ccRCC患者的分子亞型特征
為了深入對ICIs治療的轉移性ccRCC的分子表型的理解，基于與PBRM1突變和PBRM1 LOF相關的四個特征進行無監督聚類分析，并在177名患者中確定了三種分子亞型（圖2）。亞型1（n=64，36%）患者的特征是，適度表達與PBRM1突變相關上調和下調的基因，血管生成相對較低，免疫調節特征混合。有趣的是，與亞型1和亞型3相比，亞型2（n=75，42%）患者的特征是與PBRM1突變相關的上調和下調基因的表達模式一致，血管生成的表達相對較高，免疫調節信號的表達相對較低，PBRM1的突變率較高。亞型3（n=38，22%）患者的特征是與PBRM1突變相關的上調和下調基因的反向表達，血管生成的中度表達，以及較高免疫調節信號的富集（圖2）。通過整合該研究隊列的數據和CheckMate 025數據中的復發突變基因，進一步描述了六種常見突變基因的患病率，并發現亞型2（圖2）患者中VHL（n=36,48%）、PBRM1（n=44,72%）和SETD2（n=28,57%）等改變的患病率高于其他兩種亞型患者。接下來，為了評估與這些分子亞型相關的關鍵生物學特征，對每個亞型進行兩兩比較。首先，亞型1在細胞-細胞信號和細胞發育的生物學過程中富集. 其次，具有高比例PBRM1突變的亞型2上調代謝過程相關通路. 最后，亞型3特異上調細胞周期相關和免疫反應的通路（圖2）。
3.亞型2與更高的代謝過程和較低的耗竭免疫類型有關
為了評估每個亞型的預后相關性，根據每個亞型比較OS。值得注意的是，與亞型1和3相比，亞型2與OS顯著相關（圖3A）。為了進一步了解生存結果的分子機制，通過在每個亞型中使用Hallmark基因集進行基因集富集分析（GSEA）和單樣本GSEA（ssGSEA）來探索轉錄組通路差異。總的來說，18個基因集，包括炎癥反應、氧化磷酸化和E2F靶通路，在每個亞型中都被激活（圖3B）。亞型1和亞型3中免疫相關通路（炎癥反應、補體和IL6-JAK-STAT3）均激活。亞型3特異激活細胞周期進展通路（G2M檢查點、E2F靶點和有絲分裂）而比亞型1和2預后更加差。然而，在亞型2患者中，代謝（氧化磷酸化、脂肪酸代謝和脂肪生成）、缺氧和活性氧通路被激活。
為了進一步評估每個亞型的免疫相關特征，使用CIBERSORTx反卷積算法分析免疫細胞比例，根據分子亞型，未觀察到細胞類型的顯著差異（圖3C）。有趣的是，亞型3的CD8 T細胞比例較高，這與免疫治療的作用方式有關（圖3C）。這一結果可能與亞型3患者較高的免疫調節活性有關（圖2）。鑒于意外發現PBRM1高突變率的亞型2與CD8 T細胞的比例無關，我們研究了不同免疫亞型的腫瘤內在特征是否會影響ICIs的反應。因此，我們分析了分類為激活免疫和耗竭免疫的免疫亞型，據報道，它們在癌癥進展中起著不同的作用，并與患者的臨床結果相關。與其他兩種分子亞型相比，預測每個腫瘤中的免疫類型顯示，存活率最差的亞型3表現出耗竭免疫亞型的比例最高，而激活免疫亞型的比例最低。然而，與亞型1相比，亞型1和亞型2的激活免疫亞型比例相似，而存活率良好的亞型2的耗竭免疫亞型比例只有亞型1的一半（圖3D）。此外，我們根據PBRM1突變評估了免疫亞型，并確定與未發生突變的患者相比，PBRM1突變的患者表現出更高的激活免疫亞型和較低的耗竭免疫亞型（圖3D）。此外，根據免疫亞型評估PFS，包括激活免疫、耗竭免疫和非免疫亞型。我們觀察到，免疫激活亞型顯示出更好的PFS（圖3E）。這些結果表明，每個分子亞型具有不同的免疫亞型，這可能會影響與ICIs反應性相關的腫瘤微環境。此外，ccRCC中激活免疫亞型的過度免疫可能表明ICIs治療后誘導了攻擊性表型和不良預后。
4. GATM表達與PBRM1突變相關，作為ICIs治療的ccRCC患者治療反應的新生物標志物
接下來，確定與亞型2相關的關鍵調節基因，該亞型具有較高比例的PBRM1突變，并顯示出最佳的生存結果。分析了細胞系數據（GSE102806），包括與PBRM1 LOF相關的786-O和A-704細胞系。首先，通過比較治療樣本和對照樣本，得到了六個差異基因集。使用DEGs（包括DEG1、DEG2和DEG3）并通過執行ssGSEA在每個亞型中確定了不同的表達模式（圖4A）。值得注意的是，與亞型1和3相比，亞型2的上調DEG表達顯著增加，而下調DEG表達顯著降低。同樣，攜帶PBRM1突變的腫瘤表現出上調的DEGs的更高表達（圖4B）。通過overlap五個差異基因集，鑒定出可能與PBRM1突變有關的四個基因AMACR、SLC6A3、GATM和USH1C上調（圖4C）。其中，主要關注GATM和USH1C，在攜帶PBRM1突變的腫瘤中顯著差異表達。然后評估了這兩個基因的臨床相關性，在TCGA-KIRC數據和合并隊列數據中，GATM的高表達與改善的總體生存率（OS）相關（圖4D）。在TCGA-KIRC數據中，USH1C的高表達與OS的臨床結果相關（圖4D），而在合并數據中，沒有達到統計學意義（圖4D）。因此，在以下分析中，GATM被列為潛在驅動因素。
5. 免疫組織化學檢測GATM蛋白水平與良好的生存率相關
接下來，為了驗證GATM的預后作用，通過IHC染色對51例轉移性ccRCC患者的GATM蛋白表達進行評估，并根據GATM表達狀態將其分為兩組（分為GATM陽性和GATM陰性）（圖5A）。然后，研究了GATM蛋白水平與生存結果的關系。值得注意的是，與GATM陰性組相比，在ICIs治療后，GATM陽性組的PFS和OS顯著改善（圖5B）。而后，進一步分析了基于PBRM1突變狀態和分子亞型的GATM蛋白水平，發現PBRM1突變患者的GATM陽性樣本比例高于未發生PBRM1突變的患者（圖5C）。此外，還觀察到，亞型2的GATM陽性病例比例最高，而具有侵襲性表型和較差存活率的亞型3的GATM陽性樣本比例最低（圖5C）。這些結果表明，GATM蛋白水平與PBRM1突變狀態和侵襲性較低的表型相關，并顯示出潛在的臨床實用性，可作為ICIs治療轉移性ccRCC的預后標志物。
6. 在應激條件下，PBRM1缺失和GATM上調會抑制細胞增殖
檢測了ccRCC細胞系中PBRM1的缺失是否調節GATM的表達。Caki-1和786-O細胞中的PBRM1敲除顯示GATM或USH1C表達增加（圖6A）。還使用0.5μM放線菌素D（轉錄抑制劑）檢測了PBRM1在轉錄水平上是否調節GATM的表達。正如預期的那樣，與對照細胞相比，在用放線菌素D處理的786-O細胞中，PBRM1敲除后GATM轉錄物水平持續增加（圖6B）。結果表明，PBRM1基因敲除后，GATM的表達在轉錄水平上增加。隨后，將轉染siScr、siPBRM1或siGATM的786-O細胞進行體外劃痕試驗，并與高濃度過氧化氫（H2O2）孵育12小時。與對照細胞相比，暴露于H2O2中的PBRM1敲除786-O細胞幾乎沒有遷移。PBRM1基因敲除和GATM基因敲除的786-O細胞增強了細胞遷移，GATM基因敲除的786-O細胞的運動性與對照細胞中的相似（圖6C）。這些數據表明，PBRM1缺失誘導的GATM上調導致遷移能力喪失。在含有高濃度過氧化氫或低葡萄糖的培養基中培養的PBRM1缺失的細胞失去了形成菌落的能力，通過沉默GATM恢復了這種能力（圖6D）。更重要的是，研究了GATM表達和PBRM1突變與臨床預后的關系；根據PBRM1突變和GATM表達狀態，將合并數據（n=177）和TCGA-KIRC隊列分為四組：（PBRM1_MUT+高_GATM、PBRM1_MUT+低_GATM、PBRM1_WT+高_GATM和PBRM1_WT+低_GATM）。正如預期的那樣，具有PBRM1突變和GATM高表達的患者都具有最佳的OS（圖6E）。這些回顧性分析結果共同表明，PBRM1突變狀態和GATM表達被認為是ccRCC患者預后的關鍵因素。
四、總結
文章一開始從PBRM1相關分子亞型出發，逐步篩選出與PBRM1相關因子GATM，并且進行了實驗驗證，在每一個層面都進行了詳盡分析，所涉及實驗方法和分析方法也相當豐富，文章故事邏輯清晰合理，并且該研究有收集新的樣本隊列，所以可以到6+。
