仿生遞藥系統(tǒng)（MNGs）改善腫瘤免疫治療

實(shí)體瘤中淋巴細(xì)胞的有限滲透和殺瘤功能的耗盡仍然是癌癥免疫治療的一個(gè)巨大障礙。今天小編給大家?guī)硪黄}為“Macrophage Membrane-Coated Nano-Gemcitabine Promotes Lymphocyte Infiltration and Synergizes AntiPD-L1 to Restore the Tumoricidal Function”（IF: 18.027）的文章。本文作者設(shè)計(jì)了一種巨噬細(xì)胞膜包被的納米吉西他濱系統(tǒng)(MNGs)來促進(jìn)淋巴細(xì)胞的滲透，然后協(xié)同抗PD-L1來重新激活耗竭的淋巴細(xì)胞。

背景

PD-L1或PD-1檢查點(diǎn)已被證明在各種實(shí)體和血液腫瘤類型中具有顯著的治療效果。但絕大多數(shù)患者無法從這種治療方案中受益。ICIs的治療結(jié)果在很大程度上取決于腫瘤中預(yù)先存在的淋巴細(xì)胞識(shí)別和殺傷癌細(xì)胞。然而，對(duì)于非炎癥性腫瘤，會(huì)出現(xiàn)免疫沙漠，極大地限制了ICIs的反應(yīng)。因此，如何促進(jìn)淋巴細(xì)胞的滲入，增強(qiáng)抗腫瘤免疫能力，成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵問題。
越來越多的數(shù)據(jù)表明，一些治療藥物可以破壞腫瘤間質(zhì)屏障或使混亂的腫瘤血管正常化、誘導(dǎo)癌細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡和趨化因子的升高。還可以消除各種免疫抑制細(xì)胞，下調(diào)多種促腫瘤細(xì)胞因子，使抑制性腫瘤微環(huán)境重新編程為抗腫瘤功能，很大程度上ICI介導(dǎo)的免疫治療。然而，由于腫瘤間質(zhì)致密性，這些藥物在腫瘤內(nèi)的傳遞和給藥的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。
因此作者設(shè)計(jì)了一中仿生遞藥系統(tǒng)MNGs能有效促進(jìn)腫瘤內(nèi)滲透，增強(qiáng)腫瘤對(duì)癌細(xì)胞的親和性，激活反應(yīng)性藥物釋放，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而協(xié)同抗PD-L1，使耗竭狀態(tài)的浸潤性淋巴細(xì)胞恢復(fù)殺瘤功能，產(chǎn)生顯著的治療效益。
 

主要結(jié)果

• MNGs的制備和表征。

吉西他濱(Gem)是一種有效的化學(xué)免疫調(diào)節(jié)分子，可以消除多種免疫抑制細(xì)胞，增強(qiáng)免疫識(shí)別，促進(jìn)NK細(xì)胞的激活。將其設(shè)計(jì)成組織蛋白酶B敏感的疏水脂肪前藥(C₁₄-Gem)。MNGs是通過將巨噬細(xì)胞膜（MM）偽裝到由pH敏感的聚合物PEG-PDPA和C₁₄-Gem組成的納米吉西他濱系統(tǒng)（NG）上而開發(fā)的。與NGs不同的是，MNG呈現(xiàn)出典型的core?shell球形納米結(jié)構(gòu)，MM的蛋白質(zhì)組成大部分保留在MNG中(圖1a,b)。同時(shí)，MM中CD11b、CCR2和ATPase的典型信號(hào)在MNG中很容易觀察到(圖1c)。MNG可以保持巨噬細(xì)胞有趣的趨瘤特性。高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了C₁₄-Gem在NGs和MNG中的封裝效率(EE)，表明它們?cè)谀M生理液體中的良好穩(wěn)定性(圖1d)。HPLC分析表明C₁₄-Gem在細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境中具有響應(yīng)性的釋放行為(圖1e)。NGs和MNGs在pH 5.5的介質(zhì)中納米結(jié)構(gòu)崩潰(圖1f)。

此外，當(dāng)C₁₄-Gem在pH為5.5的介質(zhì)中與組織蛋白酶B孵育時(shí)，C₁₄-Gem能有效地降解為活性Gem。證實(shí)了組織蛋白酶B在C₁₄-Gem降解過程中的重要作用。因此，MNGs可以在細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境中迅速釋放C₁₄-Gem，然后被組織蛋白酶B以編程方式降解為活性Gem，發(fā)揮藥理活性。

• 腫瘤積聚和腫瘤內(nèi)滲入。

在4T1乳腺癌模型中檢測(cè)MNGs和NGs在腫瘤中的蓄積。用DiIC18(DiI)熒光探針標(biāo)記NGs和MNGs。NGs和MNGs的DiI在不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤部位均有明顯的紅色熒光信號(hào)。體外成像證實(shí)，這兩種納米載體的優(yōu)勢(shì)腫瘤聚集(圖2a，b)。然后，用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)成像測(cè)定腫瘤內(nèi)的滲透曲線。在腫瘤組織的橫斷面上，MNGs的熒光信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于NGs(圖2c，e)。然后，CLSM來評(píng)估了MNGs從腫瘤血管外溢到周圍腫瘤實(shí)質(zhì)中的情況，NGs主要局限于腫瘤血管周圍(圖2d)。MNG的紅色熒光信號(hào)在腫瘤血管周圍明顯可見，并在距離腫瘤血管管腔200μm處仍保持高強(qiáng)度。而神經(jīng)生長因子主要位于腫瘤血管周圍40μm以內(nèi)，且隨著腫瘤血管距離的增加，其熒光強(qiáng)度明顯降低(圖2f)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了MNGs在腫瘤內(nèi)滲透和腫瘤血管外滲方面的顯著效果。

之后，作者評(píng)估了在穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(4T1-GFP)的4T1癌細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤中，MNG對(duì)癌細(xì)胞部分的可及性（圖2g，h）。巨噬細(xì)胞通過NGs的腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和癌細(xì)胞可及性的增強(qiáng)可能歸因于巨噬細(xì)胞模仿腫瘤的親和性。

• 使用MNG對(duì)STM進(jìn)行重新編程。

關(guān)于Gem的免疫調(diào)節(jié)作用，作者評(píng)估了它們?cè)?T1腫瘤模型中重新編程STM的效果。首先測(cè)量了MNG在消除這些免疫抑制細(xì)胞方面的效果(圖3a)。與陰性對(duì)照相比，MDSCs、Tregs和M2樣TAM的頻率分別降低了67.96%、32.18%和73.11%(圖3b?e，)，表明MNG對(duì)清除腫瘤中多種免疫抑制細(xì)胞具有顯著效果。隨后，檢測(cè)了MNG對(duì)TGF-β1和IL10產(chǎn)生的影響(圖3f，g)。MNG能有效地清除抑制性免疫細(xì)胞，降低前列腺癌組織中TGF-β1和IL10的水平，具有顯著的緩解STM的作用。

通過免疫熒光方法研究了MNGs對(duì)腫瘤中PD-L1表達(dá)的影響。在MNG處理組，PD-L1的紅色熒光信號(hào)在4T1-GFP癌細(xì)胞及其鄰近區(qū)域廣泛檢測(cè)到，其強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其他處理組(圖3h)。MNG治療后PD-L1表達(dá)的增加可以促進(jìn)抗PD-L1介導(dǎo)的抗腫瘤免疫治療。

• MNGs促進(jìn)淋巴細(xì)胞在腫瘤中的滲透。

淋巴細(xì)胞在腫瘤中的滲透和向癌細(xì)胞巢的轉(zhuǎn)運(yùn)是腫瘤免疫治療的基本前提。CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)腫瘤殺傷功能的主要效應(yīng)細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組4T1腫瘤患者外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞(圖4a-c)。此外，腫瘤細(xì)胞分泌TNF-α和IFN-γ分別是相應(yīng)的NG治療組的1.6倍和1.31倍(圖4d)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了MNG治療能提高腫瘤中CD3+CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的頻率。

在激光共聚焦顯微鏡下用免疫熒光染色方法檢測(cè)CD8+T細(xì)胞在癌巢中的浸潤情況(圖4e)。在MNG處理組，CD8+T細(xì)胞廣泛分布在癌細(xì)胞區(qū)附近和高熒光強(qiáng)度的巢穴內(nèi)。同樣，檢測(cè)了NK細(xì)胞在腫瘤中的滲透情況(圖4f)。結(jié)果表明，MNG可顯著促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞部分的轉(zhuǎn)運(yùn)。

然后，探討了MNG促進(jìn)腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤的可能機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的浸潤主要與腫瘤血管的供應(yīng)、腫瘤間質(zhì)的阻礙和趨化因子的分泌有關(guān)。在MNG處理組，CCL5、CXCL9和CXCL10的表達(dá)分別是陰性對(duì)照組的4.35、2.82和5.31倍，是NG處理組的1.92、2.05和2.44倍（圖4g）。因此，MNG誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞趨化因子的上調(diào)可能是促進(jìn)腫瘤中淋巴細(xì)胞浸潤的主要因素。

• MNGs聯(lián)合抗PD-L1的體內(nèi)治療效果

之后，評(píng)估了MNGs及其聯(lián)合抗PD-L1在三種小鼠腫瘤模型（4T1乳腺癌模型、PANC02胰腺癌模型和CT-26結(jié)腸癌模型）中的抗腫瘤效果。其中4T1和PANC02為低免疫原性腫瘤，淋巴細(xì)胞浸潤少，PD-L1表達(dá)低，而CT-26腫瘤為高免疫原性腫瘤。在這三種模型中，MNGs的抗腫瘤作用并沒有顯著增強(qiáng)。MNG治療組腫瘤逐漸發(fā)展，達(dá)到極限死亡體積，與PBS對(duì)照組相比，生存期適度延長。當(dāng)它們與抗PD-L1聯(lián)合使用時(shí)，在這三種腫瘤模型中，MNGs+抗PD-L1組的腫瘤體積明顯小于MNG或抗PD-L1單獨(dú)治療組。與MNG或抗PD-L1單一治療相比，無論是在低免疫原性的4T1和PANC02腫瘤模型中，還是在高免疫原性的CT-26模型中，MNGs+抗PD-L1治療都顯著延緩了腫瘤的進(jìn)展，并明顯延長了總生存期(圖5)。這些數(shù)據(jù)有效地證實(shí)了MNGs在協(xié)同抗PD-L1介導(dǎo)的癌癥免疫治療方面的顯著效果。

• MNGs與抗PD-L1協(xié)同作用的可能機(jī)制

盡管MNG治療促進(jìn)了腫瘤中淋巴細(xì)胞的浸潤，但其中很大一部分處于衰竭狀態(tài)。與相應(yīng)的NGs相比，MNG治療的腫瘤中PD-L1檢查點(diǎn)的上調(diào)和浸潤性淋巴細(xì)胞的耗盡可能是抗腫瘤療效改善有限的主要原因。作者重點(diǎn)研究了MNGs+抗PDL1治療對(duì)4T1腫瘤中這些浸潤性淋巴細(xì)胞狀態(tài)和功能的影響(圖6)。MNGs+抗PD-L1處理組中PD-1 CD3+CD8+PD-1+T細(xì)胞的比例顯著降低，CD3+CD8+granzyme-B+ T細(xì)胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T細(xì)胞增加(圖6a，b)。同時(shí)，測(cè)量了它們對(duì)4T1腫瘤中浸潤性NK細(xì)胞狀態(tài)和功能的影響(圖6E?h)。因此，MNGs與抗PD-L1聯(lián)合應(yīng)用可有效恢復(fù)腫瘤中浸潤性淋巴細(xì)胞的殺瘤功能，有利于增強(qiáng)其抗腫瘤活性。

在原位胰腺癌模型和原位結(jié)腸癌模型中檢測(cè)了MNGs+抗PD-L1聯(lián)合治療的療效。與其他治療方法相比，MNGs+抗PD-L1治療可明顯降低熒光素標(biāo)記腫瘤的信號(hào)(圖7a)。MNGs+抗PD-L1聯(lián)合治療顯著延長了生存時(shí)間和生存率(圖7b)。在CT-26誘導(dǎo)的原位結(jié)腸癌模型中，MNGs+抗PD-L1治療組的中位生存期為56天，顯著高于其他組。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，在這兩種原位腫瘤模型中，MNGs+抗PD-L1聯(lián)合治療比其他治療方法有更好的治療效果。

總結(jié)

綜上所述，作者設(shè)計(jì)了一種巨噬細(xì)胞膜包裹的納米吉西他濱系統(tǒng)（MNG），以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的滲透，并協(xié)同抗PD-L1來重振耗盡的淋巴細(xì)胞，從而有效地治療癌癥。在4T1腫瘤中，MNGs表現(xiàn)出靈活的滲透性，并緩解了免疫抑制。此外，MNGs增強(qiáng)了腫瘤中淋巴細(xì)胞的浸潤，但卻意外地增加了腫瘤中耗盡淋巴細(xì)胞的比例，并增加了PD-L1的表達(dá)。MNGs聯(lián)合抗PDL1有效地恢復(fù)了浸潤性淋巴細(xì)胞的殺癌作用，并在幾種腫瘤模型中產(chǎn)生了顯著的治療效果。因此，MNG提供了一種策略來促進(jìn)淋巴細(xì)胞的滲透，并協(xié)同抗PD-L1以恢復(fù)其對(duì)腫瘤的殺瘤功能，用于癌癥免疫治療。