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1. 概述
隨著分析生物學、微流控技術和生物信息學的發展，已使研究惡性腫瘤中數千甚至數百萬個細胞的單細胞分辨率成為可能。腫瘤和相關免疫細胞及基質細胞的基因組、轉錄組、表觀基因組和蛋白質組特征的高維、多面表征使腫瘤異質性、腫瘤細胞和它們的微環境之間的復雜相互作用以及每個腫瘤進化軌跡的細節得以解剖。來自美國的研究人員在《Nature Reviews Clinical Oncology》發表了Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy文章。在該文章中，首先闡明了單細胞的轉錄組、蛋白質組、表觀基因組和基因組技術是如何改變我們對抗癌免疫治療的反應性和耐藥性的理解，并探索整合多種模式的分析方法。然后說明了單細胞T細胞受體(TCR)分析的重要性，并重點調查了單細胞空間組學分析與適用性免疫腫瘤相關的新興技術。最后，討論了單細胞技術的未來發展方向，以及它們在促進免疫腫瘤領域的發展中可能發揮的作用。
2. 單細胞組學
2.1 單細胞轉錄組
單細胞RNA測序(Single- cell RNA sequencing, scRNA-seq)是指一組技術，可以對單個細胞中的轉錄本進行非靶向定量。單細胞轉錄組scRNA- seq可識別新的細胞類型、研究罕見的細胞群、并定義細胞狀態和系統發育譜。圖1給出了腫瘤免疫單細胞分析工作流程。
2.2 腫瘤細胞和免疫治療反應
無論是在腫瘤之間還是在個體腫瘤內部，癌癥的異質性是scRNA-seq分析腫瘤細胞突出的主要特征。當患者的多個惡性細胞聚集在一起時，在膠質瘤、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和卵巢癌等疾病中，單個細胞組的轉錄譜主要是由患者的自身決定的。這種患者-患者的異質性使得用單個腫瘤細胞的scRNA-seq分析來研究患者對治療的反應變得復雜化。 因此，免疫細胞和基質細胞的單細胞分析應用于識別細胞類型和與患者之間共享的免疫治療反應相關的狀態時更加富有成效。
2.3 免疫和基質細胞及免疫治療反應
這一領域的重點是在非惡性組織中創建詳細的細胞免疫圖譜，然后將這些圖譜和方法應用到腫瘤環境中。例如，Szabo等通過分析來自肺、淋巴結、骨髓和血液的50000個靜止的和激活的T細胞所繪制的人類非惡性T細胞激活參考圖。
在免疫治療的背景下，將基于scRNA-seq分析的免疫腫瘤學方法(Table1)應用于TME中的免疫和基質細胞，能夠闡明轉錄狀態，這是免疫治療(如ICIs)的反應和抵抗的基礎。同時，單細胞轉錄組學與蛋白水平的結合，可以為新的免疫療法提供新的共表達靶點 。
2.4 相互作用分析
通過將配體受體對在不同細胞類型之間的表達關聯起來，可以從scRNA-seq數據推斷出這些重要細胞間相互作用的信息。例如:腫瘤相關的樹突狀細胞和外周血T細胞之間的相互作用。該研究涉及16例初始肝細胞癌患者，使用scRNA-seq分析腫瘤、鄰近肝臟、肝淋巴結、血液和腹水中的白細胞。譜系分析顯示一種新型的LAMP3+ DCs能夠從腫瘤轉移到淋巴結。這些LAMP3+ DCs樹突狀細胞表達了許多可能的抑制性配體受體對，并與多個T細胞亞群相關，提示其在促進T細胞凋亡中的作用以及外周血T細胞的功能障礙。
2.5 scRNA- seq的局限性。
首先，scRNA-seq數據本質上是嘈雜的，因為真核生物的轉錄并不是以相同的基礎速率進行。
其次，僅使用轉錄組數據來建立基因型和表現型之間的相關性仍然具有挑戰性。除了scRNA-seq的一些固有限制之外，與樣本采購和處理相關的具體細節也可能混淆結果。scRNA-seq依賴于可存活的單細胞懸液，但通常從外周血或淋巴結中獲得，很難從實體腫瘤組織中獲得。分離方法和低溫保存條件的差異也會引起相當大范圍的轉錄組變化。為了解決這些問題，研究人員開始制定規范組織分離和單細胞懸浮液制備的方案，其中單核RNA測序(snRNA-seq) 適用于許多不同的組織類型，與冷凍樣本兼容，有時可以提供比scRNA- seq更少的細胞覆蓋。
最后，批次效應。盡管已有多種方法來矯正這種批次效應，但存在掩蓋真實生物差異的風險。
3. 蛋白質組學
3.1 大量細胞計數方法
一般在使用質譜進行蛋白質的非靶向檢測缺乏與單細胞分析相關的足夠的靈敏度,因此，單細胞蛋白質組學的研究主要依賴于使用抗體或類似的親和試劑(如附著體或適配體)對目標的選擇性檢測。流式細胞術是研究人員在單細胞水平上評估蛋白表達的主要手段，但檢測的抗原表位數量受到熒光團光譜重疊的限制。金屬同位素標記抗體的大規模細胞檢測技術的出現，大大增加了可以同時分析的標記的數量，從而能夠對單細胞上表達的蛋白質進行高維檢測。
3.2 單細胞蛋白質組分析的新興技術
下一代光譜分析儀的出現有望擴展基于熒光的流式細胞術的能力，達到與大規模細胞術競爭的水平。這些系統相對于流式細胞術的一個優勢是能夠利用現有的大量熒光標記抗體，因為它們不像流式細胞術那樣破壞細胞，可以為后續的實驗進行分類和分離細胞。如：用條形碼寡核苷酸而不是熒光團或重金屬離子標記抗體，消除了對同時可分辨目標數量的限制。
其他抗體靶向的單細胞策略包括基于組織的細胞術(Box 1)，這增加了空間分辨率的提高水平，以及微流控細胞術，其中細胞被固定在微流控芯片上，而不是在流式中分析。芯片細胞術可以反復染色;在相同的細胞樣本上，可以檢測和量化標記的分數。單細胞條形碼芯片技術，則用于檢測單細胞所分泌的蛋白質。
3.3 基因組學方法
全基因組和全外顯子組測序的許多方法還沒有過渡到高維分析，這在很大程度上是因為這種測序的高成本妨礙了將每個患者的細胞數量擴大到相當大的數量。一種將微流體與融合液滴相結合的Tapestri系統成為了一種更有效的方法。首先使用大量腫瘤DNA樣本的深度測序來識別sSNVs，然后使用單細胞DNA定向測序來檢測導致癌變的體細胞突變或結構的突變。
3.4 表觀基因組分析方法
結合高通量測序技術的靶向開放染色質測序(ATAC-seq)、免疫共沉淀測序(ChIP-seq)、亞硫酸氫鹽DNA甲基化測序以及染色體構象捕獲(如3C和Hi-C) 都已適用于單細胞分析。在多種方法中，單細胞(sc)ATAC-seq是目前唯一具有足夠高吞吐量的方法，因此被廣泛采用 。單細胞表觀基因組學是一個快速發展的領域，特別是當與單細胞轉錄組學結合時，很可能是腫瘤學單細胞分析的下一個主要進展之一。用于單細胞DNA甲基化分析的亞硫酸氫鹽測序，以及單細胞ChIP-seq的CUT&Tag等，這些方法將進一步擴展在單個細胞水平上分析表觀遺傳變化的能力。
3.5 RNA、DNA和蛋白質。
將單細胞蛋白質檢測納入scRNA-seq協議的技術(如CITE-seq和REAP-seq)使用抗體與條形碼寡核苷酸結合，使通過scRNA-seq的cDNA測序步驟能夠檢測基于蛋白質的標記物。從而使蛋白質檢測沒有光譜重疊或可分解金屬離子數量的限制。在非靶向轉錄組分析中加入基于抗體的檢測數十到數百種蛋白質的能力，以及通過在傳統免疫學框架內定義轉錄組，可以減少因轉錄缺失而引起的歧義，從而大大提高評估TME的能力。使用寡核苷酸標記的抗體也已被納入Tapestri的工作流程，用于單細胞DNA測序，提供了連接基因型和表型的直接方法。
3.6 譜系追蹤
scATAC-seq能夠同時測量細胞系(通過線粒體基因組)和細胞命運(通過核表觀基因組)，線粒體突變也可以在scRNA-seq數據中檢測到，但沒有scATAC-seq數據穩定，因為線粒體基因組的覆蓋率較低且不一致。這種譜系追蹤分析在未來可以應用于更好地了解哪些腫瘤細胞克隆在對特定治療的反應中擴張或收縮，從而可以知道哪些克隆可能與治療抗性有關。
3.7 單細胞T細胞受體分析
T細胞是適應性免疫系統的主要部分，負責抗腫瘤免疫，因此是FDA批準的大多數癌癥免疫療法(如ICIs、過繼細胞療法、肽或RNA疫苗、基于細胞因子的療法和溶瘤病毒療法)的主要重點。
TCR是一種由兩條鏈組成的異源二聚體，基因重組可產生多種TCR序列。大多數T細胞(95%)攜帶單個TCR的α和β亞基，它們共同識別同源肽MHC抗原。基于這種TCR-肽-MHC的相互作用，免疫原性腫瘤中出現的TILs具有消除腫瘤的潛力。單細胞方法還可以識別成對的α和β TCR亞基，這是確定浸潤性T細胞特異性的關鍵一步。這些信息可能不僅有助于解釋對當前免疫療法的耐藥性(如腫瘤特異性的缺乏)，而且還有助于發現高活性的抗腫瘤TCR，這些TCR可用于新的工程TCR細胞療法。
整合scRNA-seq和scTCR-seq提供了一種特別有效的方法來分析免疫治療過程中免疫細胞的表型和功能特征。通過對T細胞的單細胞表型分析(如通過scRNA-seq)與識別它們各自的TCR克隆型相補充，這些綜合方法為免疫細胞分析增加了T細胞抗原特異性的關鍵信息，從而能夠更好地解剖抗原特異性T細胞在免疫治療反應中的作用。此外，在免疫治療過程中縱向收集的血液樣本中，對擴大的TCR克隆進行非侵入性識別，可能會為腫瘤中臨床相關TCR的識別和功能提供見解。
4. 高維空間分析技術
腫瘤免疫微環境的空間變異性越來越被認為是導致大多數癌癥類型的異質性和可變治療反應的原因。免疫組化、免疫熒光蛋白選擇性免疫染色、核酸原位雜交已經成為癌癥診斷、分類、治療選擇和預后不可缺少的空間方法（詳見BOX1）。
5. 未來的方向
盡管免疫療法已經改變了許多晚期惡性腫瘤的治療方法，但大多數患者要么對相關藥物無反應，要么最終產生耐藥性。數以千計的臨床試驗聯合免疫治療方法使得免疫和非免疫治療藥物都已經完成或在進行中。但設計合理的免疫療法——包括克服原發性或獲得性、耐藥性的組合將需要對每種癌癥類型的腫瘤免疫微環境進行綜合表征，并詳細了解在治療的背景下有效的抗腫瘤免疫的決定因素。單細胞技術能夠對TME進行全面的分析，因此特別適合于研究腫瘤和免疫細胞的異質性，以及這種腫瘤生物學上的差異如何導致治療耐藥性。
為了有效地利用單細胞技術來提高我們對免疫治療反應和耐藥性機制的理解，并幫助開發新的治療方法，臨床試驗將必須以一種可行的方式納入單細胞方法。利用數據豐富的單細胞信息和生物信息學算法，將大量RNA-seq數據映射到由scRNA- seq和相關技術定義的細胞類型上。高維單細胞技術可以更容易地應用于臨床，包括那些擴展傳統方法信息內容的技術，如免疫組化和流式細胞術。對于來自血液惡性腫瘤和其他容易分散到單個細胞的樣本，結合熒光標記物的大規模細胞術和流式細胞術已經開始成功。
6. 結論
單細胞RNA測序和相關模式正日益成為表征免疫治療反應和耐藥性的重要研究工具。此外，需要單細胞TCR分析來確定T細胞抗原的特異性，并提供適應性免疫系統在腫瘤形成、生長和治療中的作用的關鍵信息。單細胞分析的下一個前沿是將高維含量與精確的組織定位相結合。高維單細胞分析的臨床應用包括識別免疫治療反應的高維生物標記物，能夠細化批量測序數據的分析，并理解TME中復雜的細胞空間相互作用，從而驅動免疫治療的反應。考慮到可能的免疫治療基質的不斷增加，以及腫瘤異質性和治療性耐藥性的個性化特性，癌癥治療的未來是聯合治療。因此，多維的生物標記將是為每個癌癥患者做出最佳治療選擇的關鍵，而高維單細胞技術在免疫腫瘤學中將提供所需數據的分辨率和豐富性。
參考文獻
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