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在抗腫瘤免疫應答過程中，藥物的療效很大程度上取決于腫瘤特異的效應性免疫細胞的功能狀態，而效應細胞的增殖和活性受免疫檢查點共刺激和共抑制信號的共同調節。因此增加抗腫瘤免疫反應往往是通過增強作為正向調節的共刺激信號，或阻斷負向調節的抑制信號。但往往事情沒有我們想的那么簡單，尤其是在異質性很強的腫瘤微環境中，各種免疫調控網絡紛繁復雜，這也就促使我們采用多種免疫檢查點抑制劑聯合治療的方案。
目前發現具有可用于藥物治療的免疫檢查點分子有很多：PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, PVRIG, NKG2A等，因為PD-1/PD-L1和CTLA4最早被發現，也研究的最多，因此目前抗CTLA-4 與抗PD-1/PD-L1 聯合策略也被用于多種腫瘤的免疫治療中。但這種組合方式在很多腫瘤患者中的療效并不顯著，還具有很強的副作用，因此近些年科學家正不斷研究別的免疫檢查點聯合用藥方式。其中因TIM-3廣泛表達于T細胞、Tregs、B細胞、NK細胞、DCs、巨噬細胞和肥大細胞等各種免疫細胞，并與Galectin9、高遷移率組盒1(HMGB1)和癌胚抗原相關細胞粘附分子1(CEACAM-1)結合成為了近幾年基礎和臨床研究工作者的青睞。此外，TIM-3與PD-1在耗盡的T細胞和TILs上的共表達現象為聯合使用抗PD-1和抗TIM-3提供了一個思路。并且一些小鼠模型的實驗為這種組合的有效性提供了直接證據，幾個I期的抗PD-1聯合抗TIM-3的研究已經在晚期和轉移性實體腫瘤中開始施行。
那么接下來小編就先通過解讀今年發表在Nat Commun(IF:14.91)一篇名為：Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy的文章介紹免疫檢查點分子情侶PD-1/TIM-3以及Galectin-9的三角戀故事。
1.質譜分析篩選PD-1的結合蛋白
研究者首先通過IP/Western和免疫復合物的質譜分析確定了Galectin-9是PD-1的結合蛋白，且具有免疫調節活性。這里可能大家需要想到作者肯定篩選出了很多可以與PD-1結合的蛋白，然后通過實驗逐一進行功能驗證，最后發現Galectin-9蛋白具有較好的表型，因此后續都對這個蛋白進行分析。類比這樣的方法我們還可以篩選與自己研究基因相結合的蛋白，從而縮小靶基因的范圍。后續實驗證明了Galectin-9與PD-1的結合是高度選擇性的，并且是由多糖介導的，它不影響PD-1與其同源配體PD-L1的結合，也不影響PD-1和治療性抗體Pembrolizumab和nivolumab的結合。
Galectin-9主要有兩個CRD (N-CRD，C-CRD)結合位點，研究者發現Galectin-9主要通過其C-CRD與PD-1結合，而N-CRD和C-CRD均介導其與Tim-3的結合。為了確定PD-1上與Galectin-9結合的糖基化位點，將PD1上4個可能的糖基化位點(N49、N58、N74和N116)上的天冬酰胺(N)殘基分別突變為谷氨酰胺(Q)，發現N116Q突變在很大程度上影響了PD-1與Gal-9的結合，因此Galectin-9/PD-1的相互作用主要由Gal-9的C-CRD和PD-1的N116連接的糖鏈介導。
圖1：
2. Galectin-9可與PD-1和TIM-3交聯形成復合物
緊接著研究者通過平板蛋白結合實驗，發現在沒有Galectin-9的情況下，PD-1 ECD并不結合TIM-3 ECD，而Galectin-9促進了它們的協同結合。DuoLink實驗和IP/Western實驗的結果進一步證實了這一點。但神奇的是，在沒有外源Galectin-9的情況下，PD-1/TIM-3相互作用也能被檢測到，這種相互作用并不被乳糖或PD-1 N116Q突變所抑制。這就好比PD-1/TIM-3本來是一對情侶，只是感情并不是太穩定，這時生活中出現了一個和兩人都能處得來的好友Galectin-9，表面是調節二者關系，其實是和其中一人搞曖昧。
圖2：
3. Galectin-9可作為癌癥免疫治療的靶點
通過流式細胞術分析,研究者發現Galectin-9誘導的T細胞死亡可能與抗癌免疫抑制有關，因此研究者評估了抑制Galectin-9在癌癥治療中的潛力，并推測這可能是由于抑制Galectin-9后T細胞共刺激受損所致。接下來，通過將抗Galectin-9與GITR(TNFRSF共刺激受體家族的一個成員)的激動型抗體DTA-1相結合驗證了這一想法，它們的組合在不同的腫瘤模型中協同抑制了腫瘤的生長和延長了總生存期。因此，這些結果表明Galectin-9是腫瘤免疫治療的靶點，并且抗Galectin-9聯合GITR激動劑可以誘導出強大的抗腫瘤活性。
圖3：
4. 質譜流式證實抗Galectin-9治療針對特定的腫瘤浸潤性T細胞亞群
只有推測，沒有動物實驗當然是不行的，研究者接下來就在荷瘤小鼠中進行體內實驗。通過分析幾組質譜流式的結果，研究者發現抑制Galectin-9可以選擇性地擴大了瘤內TIM-3+ CD8T和CD4T細胞亞群，這也包括具有免疫抑制性的Treg細胞，并且Treg細胞在總CD45+TIL中的比例增加，特別是CD8T細胞中CD8T_1亞群的比例在抗Galectin-9處理后增加了兩倍以上。由于Treg可以特異性的抑制抗腫瘤免疫，因此接著通過聯合使用抗Galectin-9和抗GITR（可特異下調Treg）后，CD8T亞群的比例進一步增加，而Treg細胞幾乎完全喪失。因此，抗Galectin-9單一療法雖然擴增了具有效應潛能的CD8T細胞亞群。然而，它的治療效果可能會因為Treg細胞的共同擴增而受到影響。
圖4：
一般情況下，CD8T細胞在腫瘤抗原的不斷刺激下會逐漸失去功能，變成衰竭前體細胞。在這個階段的CD8T細胞會高表達TCF1，同時也表達PD-1,TIM-3，如果腫瘤抗原持續存在，CD8T細胞就會走向終末衰竭的T細胞，并且逐漸走向死亡。但是處在這個終末衰竭性T細胞狀態前的T細胞可以被抗Galectin-9治療給逆轉成具有較強增殖和分化能力的功能性T細胞，只不過同時擴增的還有Treg細胞。因此，聯合使用抗GITR來控制Treg細胞的擴增則解決了這一難題。
圖5：
5.單細胞數據揭示Galectin-9的表達分布
其實講到這，文章的主體研究思路都講完了，但是為了進一步解析Galectin-9在各類免疫細胞的表達情況，作者還分析了之前發表的一套單細胞數據。所以，這也進一步說明了數據挖掘的重要性。無論是多高級的研究思路，都是需要大數據作為支撐才變得更有說服力，這個數據可以來源于自己花錢測的，也可以來自已經發表的研究。這里作者就通過數據挖掘發現Galectin-9(LGALS9)在多種免疫細胞中都有表達，而且發現與對PD-1治療沒有應答的患者相比，應答患者表達更高水平的Galectin-9,這也證實了抗Galectin-9和抗PD-1聯合用藥的可能性。
圖6：
6.關于免疫應答研究可做的生信思路
好了，上面介紹了如何通過實驗研究免疫檢查點分子間的互作關系從而探索影響腫瘤免疫治療應答的因素，學習了一些實驗設計的研究策略。然而，為了符合小編一貫寫作的氣質，下面得對應來點別的有深意的生信干貨。其實作為數據挖掘的熱點，有關腫瘤對免疫治療應答的相關生信思路有很多，下面主要列舉幾篇今年剛發表的研究免疫治療應答的文章思路:
圖7：
第一篇解讀的是發表在Mol Ther Oncolytics（IF:7.20）雜志上篇名為“Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 + T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma”的文章。作者重新分析了已經發表的黑色素瘤單細胞數據，揭示出來7群CD8 T細胞亞群，這些亞群具有不一樣的特征。此外，作者還鑒定出了3個在衰竭性CD8 T細胞上過表達的基因(PMEL, TYRP1和EDNRB)，它們與患者的不良預后顯著相關。像這種思路，只要有數據都能很容易的復現一篇，至于發到什么樣的雜志上，就看證實的發現是否新穎。
圖8：
另一篇發表在J Immunother Cancer（IF:13.75）篇名為：CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer的文章則是從影響免疫浸潤的趨化因子著手。這個思路主要是對明星分子在不同癌型中的功能進行探索，需要通過實驗來進行功能驗證。因為明星分子被研究的很多了，除非做泛癌分析，否則基本上很難做出太新穎的東西。但是這類實驗設計很簡單，只需要證明某個明星分子在特定的癌型中通過何種方式影響免疫治療反應即可。
圖9：
如果覺得明星分子沒有太多研究新意，當然還可以通過各種生信方法篩選出關鍵基因。接下來一篇發表在Oncoimmunology（IF:8.11）的篇名為“YKT6, as a potential predictor of prognosis and immunotherapy response for oral squamous cell carcinoma, is related to cell invasion, metastasis, and CD8+ T cell infiltration”的文章就是先通過WGCNA的方法篩選出和免疫抑制相關的基因YKT6，進行后續的分析。對于這種新篩出的之前沒有報道過的基因就比較容易說故事，當然這個思路有一些運氣的成分，很有可能百費周折篩選出的基因要么沒有很好的功能，要么就已經被報道。
圖10：
如果你腫瘤免疫的生物學背景知識不強，也沒有很好的實驗平臺，那么還有最后一種選擇，那就是萬能膏藥之臨床預測模型。最后一篇發表在Front Immunol（IF:7.56）雜志上，篇名為“9-Gene Signature Correlated With CD8 + T Cell Infiltration Activated by IFN-γ: A Biomarker of Immune Checkpoint Therapy Response in Melanoma”的文章就是通過構建和免疫治療相關的臨床預測模型。有關臨床預測模型的構建，現在已經很成熟了，如LASSO,COX,NMF等模型都可以套用。這個思路前提是需要找一個較為新穎切入點，且最后能被多套數據集驗證出來，那就基本可以發表一點不錯的SCI文章了。
7.小結
本文從研究腫瘤免疫治療應答的這個科學問題著手，先是通過一篇以實驗為主的研究型文章解讀了如何通過巧妙的實驗設計篩選出有潛力的免疫檢查點分子，隨后分別解讀了一些純生信和生信聯合實驗的文章思路。有關腫瘤免疫治療問題可以研究的方向有很多，但是一般需要先了解研究癌型的免疫治療進展，有的問題在一些癌型中已經被研究的很通透，那就沒有必要再去浪費時間了，而同樣的科學問題在一些腫瘤中就還是一個未知，那這樣的問題就比較有研究的價值了。此外，就像開頭說的因為免疫治療應答與否牽扯的問題主要和免疫細胞的比例有關，而免疫細胞在腫瘤中的占比不高，因此bulk測出來的高表達基因主要是腫瘤細胞自身的基因，從這個角度看基于bulk數據差異分析找出的高表達基因需要用腫瘤細胞系去做實驗驗證。而單細胞數據就比較利于揭示免疫細胞上表達和免疫治療的基因，但是商品化的10X平臺可測得的基因不多，小編的經驗是先從單細胞數據揭示各種免疫細胞的比例，找出應答和非應答的差異免疫細胞亞群，從而進一步找出高表達的基因，最后通過簡單實驗進行免疫細胞的功能驗證就基本都可以發表一篇不錯的生信文章了。
