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今天來給大家分享一個基于DNA甲基化譜估計腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）豐度的方法——DIMEimmune (Differential Methylation Analysis for Immune Cell Estimation)。該方法于今年五月份發表在OncoImmunology (IF = 5.869)上，通過利用DNA甲基化譜來穩健地估計中樞神經系統（CNS）腫瘤中的浸潤淋巴細胞。該方法不依賴于所研究的腫瘤實體中的純腫瘤細胞的參考signature，可以直接應用于任何CNS腫瘤。
研究背景：
（1）免疫微環境是腫瘤生長和進展的關鍵因素。隨著越來越多的證據表明腫瘤微環境影響治療結果，免疫療法對腫瘤免疫學的興趣越來越大。
（2）腫瘤浸潤性淋巴細胞(TILs)已被證實是幾種實體腫瘤的重要預測和預后生物標志物。在神經腫瘤學中，TILs主要在膠質母細胞瘤中進行研究，并顯示與分子變異相關，如NF1和RB1突變。中樞神經系統腫瘤與浸潤淋巴細胞的相互作用在腫瘤的發生和發展中起重要作用，可能與治療應答有關。
（3）腫瘤浸潤免疫細胞的量化方法有多種，比如在蘇木精和伊紅(HE)染色的切片上可以進行TILs的評分，這在乳腺癌、肺癌或膠質母細胞瘤中很常見。同時機器學習方法被用于優化形態學的TIL量化，但對于免疫細胞形態相似的腫瘤（如小圓藍細胞腫瘤）中該方法就難以實現。
（4）基于基因表達的方法已經成功地用于描述腫瘤微環境，而基于甲基化數據推斷微環境信息的方法卻很少。而利用分子診斷如甲基化數據來確定浸潤程度和免疫細胞亞群表型是值得推薦的。
研究結果：
一、腫瘤浸潤淋巴細胞特異性signature的定義：
基本分析內容：腫瘤和淋巴細胞以及外周血中不同免疫細胞群之間的DNA甲基化差異。
數據來源及相關處理:
（1）將來自85個不同實體的2706個樣本用來作為不同腫瘤類型的參考；對于免疫細胞，用到了CD4+T細胞和CD8+T細胞的甲基化譜（如圖1a）。
（2）對腦腫瘤和免疫細胞應用不同的t檢驗統計結果，可得到淋巴細胞特異性CpG位點 (Selected CpGs 1)。考慮到CD4+和CD8+T細胞識別到的特異性位點會具有overlap，作者對來自外周血的免疫細胞群之間的甲基化均值進行了差異甲基化分析和閾值分析，以確定出CD4+和CD8+T細胞的特異性位點 (Selected CpGs 2 + 3)。此外，通過對CD4+和CD8+ T細胞聯合組進行差異甲基化分析，計算混合TIL信號。最終選取三組Selected CpGs的交集作為signature。假設Selected CpGs的腫瘤譜的主要方差依賴于于浸潤淋巴細胞的數量，通過PCA來對腫瘤隊列中的Selected CpGs降維（如圖1b）。
（3）為了驗證方法，作者將估計的免疫細胞評分與基于免疫組織學圖像的淋巴細胞計數進行比較，同時還與基因表達譜分析得到的signature進行了比較。因此，將訓練階段獲得的PCA應用于signature中CpGs的獨立測試樣本的甲基化值，那么第一組分被定義為對相應淋巴細胞群浸潤的估計（如圖1c）。
二、對計算得到的signature進行分析：
（1）作者定義了CD4+ (DIMECD4) 和CD8+ T細胞 (DIME-CD8) 的特異性甲基化signatures，以及腫瘤浸潤淋巴細胞 (DIME-TIL) 的混合signature，用來估計對應細胞類型的bulk甲基化譜的浸潤量（如圖2a-c）。
（2）為了獲得三個signature的詳情，并將它們與MeTIL進行比較，作者將它們應用于flow-sorted血液數據（如圖2d）。
（3）接下來進行了基因本體富集來識別與淋巴細胞特異性CpG信號相關的通路 (如表1) 。
三、免疫細胞估計值與免疫組織學結果的驗證和比較：
（1）作為第一次驗證，作者將基于甲基化的T細胞浸潤評分(DIME-TIL、MeTIL和MethylCIBERSORT的T細胞標記之和) 與來自47例診斷病例的免疫組織學圖像中的T細胞計數進行了比較（如圖3）。
四、免疫細胞估計值與基于基因表達的結果的驗證和比較：
（1）作為第二次校準，作者使用了RNA-seq和基因表達分析的結果。驗證數據包括5種類型的腫瘤： 763個髓母細胞瘤(MB)， 129個室管膜瘤(EPN)， 88個非典型畸胎瘤/橫紋瘤(ATRT)， 532個低級別膠質瘤(LGG)和64個膠質母細胞瘤(GBM)，這些腫瘤的甲基化和RNA-seq數據都是可用的。
（2）作者將DIMEimmune方法與之前發表的兩種甲基化方法(MethylCIBERSORT和MeTIL)的結果進行了比較。與基于MeTIL的估計相比，DIMEimmune在5個腫瘤實體中都具有更好的相關性（如圖4a）。然后將來自MethylCIBERSORT(“CD4_Eff”+“Treg”)的CD4估值和DIME-CD4與基于基因表達的T細胞估值進行比較（如圖4b），DIME-CD8在GBM中具有最高的相關性，但在MB中不具有顯著相關，而MethylCIBERSORT方法的CD8 估計值在ATRT中具有最高的相關性，在LGG中的相關性較弱，在MB中具有負相關，其它的都不顯著。
（3）最后，將基于甲基化的CD8估計值與基于基因表達的CD8+ T細胞估計進行了比較 (如圖4c)。
總的來說，與之前發表的算法相比，除了在ATRT中對CD8+ T細胞的MethylCIBERSORT估計值以外，DIMEimmune方法與基于基因表達的結果具有更高的相關性。
五、腦腫瘤中的淋巴細胞浸潤：
（1）作者使用DIME-TIL估計Heidelberg腦腫瘤分類器的驗證集(n = 1104)。和預期一樣，最高的TIL評分出現在中樞神經系統淋巴瘤(LYMPHO，如圖5a)。此外，炎癥和反應性對照組織(CONTR, REACT和CONTR, INFLAM)中TIL評分較高。
（2）為了更詳細地了解TILs在不同腦腫瘤亞組中的分布情況，作者將該方法應用于LGG、GBM、MB、ATRT和EPN的驗證數據。結果發現6個膠質瘤實體之間的TIL評分差異非常顯著 (如圖5b, p = 1.6e-36)。在IDH(異檸檬酸脫氫酶)突變的少突膠質細胞瘤和IDH突變的星形細胞瘤中浸潤估計評分最低，而在間充質膠質母細胞瘤中最高。對于髓母細胞瘤，盡管分子亞組間差異有統計學意義(p = 1.7e-49)， TIL評分總體較低。髓母細胞瘤4組中數目最少，3組中數目最多(如圖5c)。ATRTs顯示明顯的淋巴細胞浸潤。ATRT MYC亞組的TILs明顯高于TYR(中間)和SHH(最低)ATRT (p = 0.00012，如圖5d)。室管膜瘤亞組間TIL評分差異顯著(p = 4.4e-0.8，如圖5e)，其中YAP和PF B亞組得分最低，PF A和RELA亞組評分最高。
六、 腫瘤浸潤淋巴細胞與生存的關系：
最后，作者研究了TIL估計與膠質瘤、MB、ATRT和EPN總生存率之間的關系。在整個膠質瘤隊列中，DIME-TIL評分是一個明顯的不良預后因素(p = 6.06e-15, HR = 6.26)。然而，在基于甲基化的診斷亞組中，與生存率沒有顯著相關性(如圖5f)。同樣，DIMETIL評分在髓母細胞瘤中也是一個不良預后因素(p = 0.003, HR = 4.3)，但在甲基化定義的亞組中并非如此(如圖5g)。與ATRT的生存率沒有顯著相關性，可能是由于與其他腫瘤類型相比樣本量低(如圖5h)。在有足夠的生存數據的室管膜瘤和研究亞組中，TIL評分也與生存無關。(如圖5i)。
文章小結：
該文章基于差異甲基化分析建立了估計CNS腫瘤中CD8+ T細胞(DIME-CD8)、CD4+ T細胞(DIME-CD4)和腫瘤浸潤淋巴細胞(DIME-TIL)的方法。以基于免疫組織圖像的淋巴細胞計數和基于基因表達的TIL估計為參考，該方法比以往的甲基化相關方法 (DIMEimmune, MeTIL和MethylCIBERSORT) 表現得更好。在淋巴細胞浸潤更明顯的腫瘤中，估計最可靠。由于它可以應用于任何腦腫瘤實體，因此在即將進行的涉及中樞神經系統腫瘤甲基化數據的研究中，它可以有助于識別TILs作為預后或預測因素。
