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各位小伙伴大家好呀，今天小編給大家帶來今年3月23號剛剛發表在Journal of Medical Virology(IF=20.693)的一篇文章。提前劇透一下，這篇文章全為公共數據并且不會有任何一個你不會的分析。但是為什么作者可以發20+呢？且聽我細細道來！一定要看到最后哦，保證讓你眼前一亮！
一.研究背景
登革病毒(DENV)是一種急性節肢動物傳播的黃病毒屬，對人類的公共衛生造成威脅。血管通透性增加、凝血障礙和出血性素質是重癥登革熱的病理生理特征。缺乏特定的抗病毒治療、疫苗和護理診斷阻礙了對登革熱病毒的控制。盡管大量證據表明IFN介導的先天免疫在防御DENV感染中起著至關重要的作用，但由此釋放的關鍵干擾素刺激基因(ISGs)尚不清楚。因此，作者從公共數據庫收集了健康對照者和登革熱患者的外周血單核細胞的bulk和單細胞轉錄組數據，通過多種生信分析篩選和驗證了關鍵的ISG IFI27，并在單細胞水平上得到了進一步證實。提示IFI27可能作為登革熱的潛在診斷標志物和治療靶點。
二.主要結果
1. 健康對照組和登革熱患者PBMC中DEGs的聯合分析
作者從GEO數據庫上下載了GSE51808數據集，其中包含28例DENV和9例健康樣本的外周血基因表達信息。去除批次效應后，使用limma包進行差異表達分析，共獲得203個DEGs，其中140個表達上調，63個表達下調(圖1A、B)。接下來作者又在3個數據集中計算了DEGs，最終確定了三個數據集中87個交集DEGs(圖1C)。此外，為了識別DEGs之間的潛在相互作用，作者構建了一個PPI網絡(圖1D)，確定了8個關鍵基因(CREBBP、STAT1、ISG15、IFI35、IFI44、IFI27、OAS1和MRPL20)，其中IFI127具有最顯著的p值(圖1E)。
2. 診斷性biomarkers的識別和驗證
在這一部分，作者使用LASSO(圖2A)和SVM-RFE(圖2B)兩個機器學習算法對biomarkers進行識別，在這兩種算法中篩選出7個重疊的診斷相關基因(GRAMD1C, IFI27, TIGD3, CEP55,HEY1,GGTA1和CD1C)(圖1C)。作者發現，在訓練集和測試集中，IFI27在DENV樣本中的表達均顯著高于對照樣本(圖2D)。ROC曲線顯示，IFI27在訓練集和測試集中AUC值均較高，提示IFI27具有較高的診斷價值(圖2E)。(PS:這里存疑，AUC這么高真的不是過擬合了么？)
接下來，作者研究了IFI27在登革熱病毒復制中的作用。通過熒光和qRT-PCR檢測了質粒的轉染效率，發現與載體組相比，過表達后IFI27水平升高(圖2F、G)。此外，與載體組相比，IFI27過表達正向調節DENV-2感染(圖2H)。作者還研究了IFI27在登革熱感染中的作用，使用shRNA來敲低人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中IFI27的表達，觀察到經IFN處理的HUVEC能夠抑制DENV-2，而IFI27敲低則逆轉了這種能力(圖2I)。最后，作者發現與載體組相比，IFI27過表達正向調節DENV-2感染(圖2j)。綜上所述，FI27對HUVECs中DENV-2復制具有較強的抑制作用。
3. 免疫細胞浸潤景觀及GSEA分析
在這一部分，作者通過cibersort算法計算并分析了DENV和對照PBMC中的免疫細胞浸潤比例。結果顯示(圖3A)，與對照組相比，DENV PBMCs中記憶性B細胞、漿細胞、CD4記憶活化T細胞、單核細胞、巨噬細胞、M1和M2巨噬細胞、靜息態DC和靜息態肥大細胞(圖3B)；相反，對照組的中性粒細胞比例較高(圖3B)。
接下來，作者對DENV患者的PBMCs中浸潤的免疫細胞進行了相關性分析，結果表明記憶B細胞和漿細胞表現出最顯著的協同作用。活化記憶性CD4+T細胞和中性粒細胞的競爭效應最強(圖3C)。此外，作者還研究了IFI27表達與免疫細胞浸潤之間的相關性。IFI27表達與單核細胞、M1巨噬細胞激活呈正相關與CD8 T細胞、γδT細胞、na?ve B細胞呈負相關(圖3D)。
為了探索IFI27在登革熱中的潛在分子功能，作者進行了GSEA分析。結果表明，IFI27主要富集于先天免疫反應(圖4A)、對病毒的反應(圖4B)、對病毒生命周期的調控(圖4C)以及對1型IFN的反應(圖4D)。此外，作為一個ISG，IFI27還參與IFN應答基因(圖4E)、IFN α/β信號傳導(圖4F)、ISG的抗病毒機制(圖4G)和JAK-STAT信號通路(圖4h)。DENV組中IFN應答基因的顯著上調進一步證明了其通過ISG在轉錄水平抑制病毒復制。
4. 單細胞分析
為了更加細致的刻畫IFI27在登革熱中的作用，作者在GEO數據庫中下載了登革熱患者及健康對照樣本的PBMC單細胞測序數據(GSE154386)，經過質量控制，共28919個細胞被識別為23個簇(圖5A)，通過經典的Marker基因注釋為多種細胞類型(圖5B、C)。
Toll樣受體(TLRs)識別病原體共有的分子，在對抗病毒感染的固有免疫中發揮關鍵作用。于是作者在單細胞水平上研究TLRs的表達情況。與對照組相比，登革病毒感染組TLR1、TLR2、TLR4表達增高，主要表達于單核細胞、髓樣DC (myeloid DCs, mDCs)、CD16+單核細胞、CD16+ CD14+單核細胞，并伴有IFI27的高表達；TLR7和IFI27主要共表達于單核細胞、血小板、漿母細胞、漿細胞樣dc (pDCs)和CD16+ D14+單核細胞(圖6A)。
作者還對DENV組和對照組之間所有細胞、單核細胞(圖6B)、CD16+單核細胞(圖6C)、CD16+ CD14+單核細胞(圖6D)和pDC(圖6E)的進行了DEG分析，發現上調的基因主要集中在ISGs中，其中上調IFI27的細胞類型最多。
5. DENV重塑了PBMC中的細胞間相互作用和細胞因子信號
在這一部分，作者通過CellPhoneDB對健康對照和登革熱患者主要細胞類型之間的配體受體對和分子相互作用進行了分析。與健康對照相比，登革熱患者中4種主要細胞類型(單核細胞、CD16+單核細胞、CD16+ CD14+單核細胞和pDC)與其他細胞之間的通訊較少(圖7A、B)，這表明免疫細胞之間的通信是由病毒控制的。
接下來，作者在健康對照組和登革熱患者的四種主要細胞亞群和其他細胞之間篩選配體-受體對。其中，LGALS9信號改變最為顯著。與健康對照組相比，登革熱患者中LGALS9及其受體CD47之間的相互作用在四種主要細胞亞群和其他細胞中顯著增加(圖7C、D)。
至此，這篇文章就介紹完啦。我們來總結一下：第一步作者在bulk數據中篩選了登革熱患者和健康對照PBMC間的差異表達基因，并通過Lasso等機器學習算法對篩選的差異表達基因進行進一步的降維，得到了關鍵的基因IFI27，加以實驗證明了IFI27對DENV-2復制具有較強的抑制作用；第二步，作者分析了登革熱患者的免疫微環境情況，并通過GSEA研究了IFI27所涉及的生物學過程；第三步在單細胞數據中進行更加細化的分析，IFI27在DENV患者和健康對照的多種細胞類型間差異表達。縱觀全文，bulk、單細胞、實驗全都有，且每一塊兒都可以算是基礎的分析了，最重要的還都是公共數據，但是作者為什么能發表在IF20+的期刊上呢，下面小編帶著你來分析一下，首先我們來看一下期刊情況：
該期刊屬于中科院大類學科醫學4區，小類學科病毒學4區，影響因子從20年的2.327直升的20.693，發文量也是在這一年將近3倍的增長，可謂是時勢造英雄！但是，對于這種期刊是否可以投，那就仁者見仁智者見智啦。(PS：在這里夾帶一個私貨，paperneed(https://www.paperneed.cn/articles/search)查期刊文章信息真的超級好用喲，我不允許2023年的你還不知道！)
其次，我們來細細品一下文章內容：干擾素相關基因一直是研究熱點這個毋庸置疑，再加之腫瘤領域現在大家卷的厲害，20分左右的文章首先需要創新性的實驗設計，并且沒有可觀的自測樣本量以及實驗支撐很難以純生信加公共數據集登陸。但是非腫瘤領域不一樣呀，沒那么卷且不需要太復雜的分析思路，將腫瘤領域流程化的分析思路拿到非腫瘤領域完全可行。這篇文章再一次給我們證明了一點：基礎生信分析加簡單實驗驗證永遠是短平快的發文利器，而且選刊很重要哦！小伙伴們快快行動起來，你離20分的文章并不遙遠！
