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口腔問題影響著越來越多的人，據統計因患牙周炎拔牙的占拔牙總數的40%左右，它還會引起口臭、牙齒脫落等癥狀。今天小編就給大家來分享一篇關于牙周炎的單細胞測序文章。
牙周炎免疫微環境單細胞landscape
背景
慢性牙周炎是一種由牙周組織慢性炎癥組成的常見病，它是一種高度流行于人類的疾病，影響著全球約20%-50%的人口。慢性牙周炎患者通常由于局部炎癥引起的破骨細胞(OC)介導的骨侵蝕增加和成骨細胞(OB)介導的骨形成減少而導致牙槽骨丟失。慢性牙周炎還容易引起系統性疾病，如心血管疾病、糖尿病、阿爾茨海默病以及胃腸道疾病等。在牙周炎的發展過程中，大量的免疫細胞通過產生影響骨細胞的細胞因子和生長因子來激活和調節免疫反應，如破骨細胞和成骨細胞活性。免疫細胞主要包括巨噬細胞，調節性T細胞(Tregs)，TH17細胞，記憶B細胞和漿細胞等。
樣本情況和研究思路
1. 樣本情況：這篇文章中所用到的樣本包括有4例健康對照（HCs）、5例嚴重慢性牙周炎(PDs)患者以及3例接受治療后1個月內又復發的患者（PDTs）。
2. 研究思路：
本研究對三組不同來源的樣本組織分別進行了單細胞測序，然后根據已知標記基因對整體數據進行分群和注釋，對三個組的總體細胞類型比例進行了統計；之后再對所注釋的細胞群逐一進行分析，包括再分群、注釋、你時間分析、富集分析以及差異分析等。實驗方面，研究人員進行了流式分選、免疫熒光等實驗作為對數據分析結果的驗證。
結果
1. 人牙周組織的細胞組成
在所有樣本中一共捕獲了51248個細胞，分別是HCs 中的14552個單細胞，PDs中含 19865個單細胞以及PDTs 中的16831個單細胞。進行UMAP分析后可以得到10個細胞類群，并根據標記基因對每一個類群進行注釋，分別是T細胞、B細胞、漿細胞、內皮細胞、中心粒細胞、單核細胞、成纖維細胞、肥大細胞、上皮細胞和髓系抑制性細胞（MDSCs）。同時也分析了不同類型樣本中細胞類群的存在情況（圖1B）以及具有代表性的標記基因在細胞群體中的表達差異情況（圖1C）。此外，研究人員還比較了每個細胞類群在不同樣本集中的比例（圖1D），可以發現與HC組相比，PD組的T細胞群的比例顯著減少，其他類型的細胞在不同樣本中的比例也存在差異。
2. 成纖維細胞的異質性
成纖維細胞在調節組織穩態、協調炎癥反應以及介導組織損傷等機制中都起著重要作用，所以研究人員通過UMAP進一步分析了成纖維細胞類群，得到了四大類型細胞亞群，包括六個成纖維細胞亞群、兩個周細胞亞群、一個肌成纖維細胞亞群和一個增殖細胞亞群（圖2A）。再對成纖維細胞亞群進一步的聚類分析發現了四個具有獨特表型和功能的成纖維細胞的亞群(sCs)和三個成骨細胞譜系細胞亞群（圖2B），且PD樣本牙周組織中發現有大量了CXCL1+、CXCL13+和LAMP5+亞群（圖2C），這三個亞群中檢測到有TNFRSF21的表達。
3. 成骨細胞
在骨免疫微環境中，骨髓間充質干細胞（MSCs）具有成纖維細胞樣形態，可以分化為多種細胞類型，包括成骨細胞譜系細胞。接下來，研究人員用流式分選從正常對照樣本牙周組織中分離CD55+/NT5E+/LepR+或CD45-/CD55+細胞。結果表明，CD55+/NT5E+/LepR+細胞具有間充質干細胞的特性，在體外表現出多向分化的潛能（圖1D）。免疫熒光分析發現，在HC樣本的牙周組織中檢測到在LepR+細胞類群表面CD55明顯高表達，而在PD樣本中，CD55+LepR+類群表達相對較低(圖2E)。通過對MSCs、pre-OBs和OBs細胞類群的擬時間分析，發現了MSCs向pre-OBs和OBs進化的趨勢（圖2F）。同時研究人員也對三類細胞中基因的差異表達情況進行分析（圖2G）以及富集分析（圖2H）。
4. 周細胞
然后研究人員又對周細胞亞群進行了分析。周細胞作為壁細胞保護血管完整性，具有自我更新的特性。作為多能性成體干細胞，它們可以參與組織修復和再生的過程，并分化為多個譜系。因為缺乏特異性標記基因，所以研究人員將來自周細胞和肌成纖維細胞的單細胞數據進行合并，分析發現合并的周細胞和肌成纖維細胞一致表達RGS5，但典型的標記基因的表達情況又有不同（圖3A）。通過對四個轉錄上不同的KCNJ8+周細胞亞群分析發現只有sC2這一類群中表達了高水平的CXCL12（血管周圍MSCs的標志基因），而且這一類細胞在初始牙周治療后仍然存在。與HC組相比，PD組的SPON2+周細胞明顯上調（圖3B）。
為了確定譜系關系和相應的基因表達，研究人員進行了擬時間分析（圖3C）。同時也評估了在兩種細胞命運中負責MSC-like周細胞分化的基因表達模式，發現COL1A1、POSTN和SPON2的表達在fate 2分支中下調，但在fate 1分支中顯著上調(圖3D)。與前一部分一樣，研究人員也探究了其中的基因表達情況和富集情況（圖3E-F）。
5. 破骨細胞
單核細胞、巨噬細胞、OCs和樹突狀細胞都是單核細胞，能夠感知和應對炎癥和骨損傷。在單核細胞群中，研究人員鑒定出了兩個單核細胞群、三個巨噬細胞群、一個OCs群和DCs細胞群（圖4A），并根據標記基因對這些細胞群進行注釋（圖4B）。與HC組相比，PD組的巨噬細胞數量顯著增加，但在牙周初始治療后有所減少（圖4C）。說明初始牙周治療可以通過抑制破骨功能有效地來防止額外的骨質流失。通過擬時間分析發現這些細胞類群在進化上并沒有分支（圖4D）。研究人員進一步分析了參與連續進化的基因表達模式，cluster1和cluster3的基因在破骨細胞形成過程中受到抑制，主要富集在炎癥反應相關通路中（圖4E-F）。同時，與免疫細胞分化相關的轉錄因子，如HMGB2、305 BCL6和FOS，隨著分化軌跡逐漸下調(圖4G)。相反，一些破骨細胞相關因子，如NFATC1、JUN、MAFB、JDP2在此過程中上調(圖4G)。此外，IL1B和CCL20在巨噬細胞中表達量高，而在破骨細胞生成中表達量降低(圖4H)。
6. 內皮細胞
由于炎癥浸潤增強，牙周病變中可見大量內皮細胞(圖1D)。研究人員從4461個內皮細胞中鑒定了10個不同類型的內皮細胞群(圖5A)。靜脈內皮細胞和動脈內皮細胞的相對百分比在PD組高于HC組，而PDT組與PD組相比沒有顯著差異。PD組的淋巴ECs也有類似的變化情況，盡管并沒有統計學上的顯著差異(圖5A-C)。研究人員還對ECs中的轉錄因子進行了分析（圖5D-E），發現SOX17和TEAD3可能參與體內平衡和炎癥條件下動脈再生，可能與牙周微環境中動脈ECs的改變相關。差異分析發現，在PD vs HC，PDT vs PD 以及PDT vs PD這幾種情況下，CSF3都處于上調狀態（圖5F）。
7. T細胞和B細胞在牙周組織微環境中的異質性
免疫細胞是慢性炎癥的重要調節因子，于是研究人員最后對免疫細胞這一類群進行的探究，包括T細胞、B細胞以及漿細胞（圖6A）。首先是對這些亞群進行分群聚類和標記基因注釋（圖6B），從中識別出了NKT細胞、CD4+細胞、CD8+細胞。然后又從CD4+細胞群和CD8+細胞群中分別聚類出六個CD4+系細胞亞群和七個CD8+系細胞亞群（圖6C-D）。之后便是富集分析，比較了不同組別樣本之間富集通路的差異（圖6E），此外，還在CD8+細胞亞群中檢測到了關鍵免疫檢查點基因（圖6F）。分析完T細胞，研究人員又對B細胞也進行了一系列分析（圖6G-J），包括分群、注釋以及富集分析等。
8. 細胞通訊
逐一對所關注的細胞類群進行分析后，研究人員還進行了細胞通訊分析（圖7），因為研究骨細胞與免疫細胞之間的相互作用有助于進一步了解牙周炎的發病機制。因此他們采用CellPhoneDB識別主要細胞類型中的受體-配體對，共識在HC、PD和PDT組的樣本中鑒定了91699對配體-受體相互作用對。
正如圖8所示，牙周治療后牙周組織中骨免疫細胞之間存在相互作用調節網絡。
小結
本文主要是通過單細胞測序技術從單細胞層面對牙周炎免疫微環境中不同類型的細胞類群逐一進行分析。整體思路比較簡單，概括來說就是分群，注釋，然后是對注釋完的細胞亞群進行再聚類和分析，最后是對不同類型的細胞進行了細胞通訊分析。當然，這篇文章并不是純數據分析，其中也做流式和熒光染色等這些實驗。但是其中對于單細胞數據分析的思路也是值得我門借鑒的。
參考文獻
Yue Chen, Hua Wang, Wen Sun. Single-cell RNA landscape of the osteoimmunology microenvironment in periodontitis.
