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口腔問題影響著越來越多的人，據(jù)統(tǒng)計因患牙周炎拔牙的占拔牙總數(shù)的40%左右，它還會引起口臭、牙齒脫落等癥狀。今天小編就給大家來分享一篇關(guān)于牙周炎的單細(xì)胞測序文章。
牙周炎免疫微環(huán)境單細(xì)胞landscape
背景
慢性牙周炎是一種由牙周組織慢性炎癥組成的常見病，它是一種高度流行于人類的疾病，影響著全球約20%-50%的人口。慢性牙周炎患者通常由于局部炎癥引起的破骨細(xì)胞(OC)介導(dǎo)的骨侵蝕增加和成骨細(xì)胞(OB)介導(dǎo)的骨形成減少而導(dǎo)致牙槽骨丟失。慢性牙周炎還容易引起系統(tǒng)性疾病，如心血管疾病、糖尿病、阿爾茨海默病以及胃腸道疾病等。在牙周炎的發(fā)展過程中，大量的免疫細(xì)胞通過產(chǎn)生影響骨細(xì)胞的細(xì)胞因子和生長因子來激活和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，如破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性。免疫細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)，TH17細(xì)胞，記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞等。
樣本情況和研究思路
1. 樣本情況：這篇文章中所用到的樣本包括有4例健康對照（HCs）、5例嚴(yán)重慢性牙周炎(PDs)患者以及3例接受治療后1個月內(nèi)又復(fù)發(fā)的患者（PDTs）。
2. 研究思路：
本研究對三組不同來源的樣本組織分別進行了單細(xì)胞測序，然后根據(jù)已知標(biāo)記基因?qū)φw數(shù)據(jù)進行分群和注釋，對三個組的總體細(xì)胞類型比例進行了統(tǒng)計；之后再對所注釋的細(xì)胞群逐一進行分析，包括再分群、注釋、你時間分析、富集分析以及差異分析等。實驗方面，研究人員進行了流式分選、免疫熒光等實驗作為對數(shù)據(jù)分析結(jié)果的驗證。
結(jié)果
1. 人牙周組織的細(xì)胞組成
在所有樣本中一共捕獲了51248個細(xì)胞，分別是HCs 中的14552個單細(xì)胞，PDs中含 19865個單細(xì)胞以及PDTs 中的16831個單細(xì)胞。進行UMAP分析后可以得到10個細(xì)胞類群，并根據(jù)標(biāo)記基因?qū)γ恳粋€類群進行注釋，分別是T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中心粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞和髓系抑制性細(xì)胞（MDSCs）。同時也分析了不同類型樣本中細(xì)胞類群的存在情況（圖1B）以及具有代表性的標(biāo)記基因在細(xì)胞群體中的表達差異情況（圖1C）。此外，研究人員還比較了每個細(xì)胞類群在不同樣本集中的比例（圖1D），可以發(fā)現(xiàn)與HC組相比，PD組的T細(xì)胞群的比例顯著減少，其他類型的細(xì)胞在不同樣本中的比例也存在差異。
2. 成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性
成纖維細(xì)胞在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)、協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)以及介導(dǎo)組織損傷等機制中都起著重要作用，所以研究人員通過UMAP進一步分析了成纖維細(xì)胞類群，得到了四大類型細(xì)胞亞群，包括六個成纖維細(xì)胞亞群、兩個周細(xì)胞亞群、一個肌成纖維細(xì)胞亞群和一個增殖細(xì)胞亞群（圖2A）。再對成纖維細(xì)胞亞群進一步的聚類分析發(fā)現(xiàn)了四個具有獨特表型和功能的成纖維細(xì)胞的亞群(sCs)和三個成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞亞群（圖2B），且PD樣本牙周組織中發(fā)現(xiàn)有大量了CXCL1+、CXCL13+和LAMP5+亞群（圖2C），這三個亞群中檢測到有TNFRSF21的表達。
3. 成骨細(xì)胞
在骨免疫微環(huán)境中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，可以分化為多種細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞。接下來，研究人員用流式分選從正常對照樣本牙周組織中分離CD55+/NT5E+/LepR+或CD45-/CD55+細(xì)胞。結(jié)果表明，CD55+/NT5E+/LepR+細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，在體外表現(xiàn)出多向分化的潛能（圖1D）。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，在HC樣本的牙周組織中檢測到在LepR+細(xì)胞類群表面CD55明顯高表達，而在PD樣本中，CD55+LepR+類群表達相對較低(圖2E)。通過對MSCs、pre-OBs和OBs細(xì)胞類群的擬時間分析，發(fā)現(xiàn)了MSCs向pre-OBs和OBs進化的趨勢（圖2F）。同時研究人員也對三類細(xì)胞中基因的差異表達情況進行分析（圖2G）以及富集分析（圖2H）。
4. 周細(xì)胞
然后研究人員又對周細(xì)胞亞群進行了分析。周細(xì)胞作為壁細(xì)胞保護血管完整性，具有自我更新的特性。作為多能性成體干細(xì)胞，它們可以參與組織修復(fù)和再生的過程，并分化為多個譜系。因為缺乏特異性標(biāo)記基因，所以研究人員將來自周細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進行合并，分析發(fā)現(xiàn)合并的周細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞一致表達RGS5，但典型的標(biāo)記基因的表達情況又有不同（圖3A）。通過對四個轉(zhuǎn)錄上不同的KCNJ8+周細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn)只有sC2這一類群中表達了高水平的CXCL12（血管周圍MSCs的標(biāo)志基因），而且這一類細(xì)胞在初始牙周治療后仍然存在。與HC組相比，PD組的SPON2+周細(xì)胞明顯上調(diào)（圖3B）。
為了確定譜系關(guān)系和相應(yīng)的基因表達，研究人員進行了擬時間分析（圖3C）。同時也評估了在兩種細(xì)胞命運中負(fù)責(zé)MSC-like周細(xì)胞分化的基因表達模式，發(fā)現(xiàn)COL1A1、POSTN和SPON2的表達在fate 2分支中下調(diào)，但在fate 1分支中顯著上調(diào)(圖3D)。與前一部分一樣，研究人員也探究了其中的基因表達情況和富集情況（圖3E-F）。
5. 破骨細(xì)胞
單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、OCs和樹突狀細(xì)胞都是單核細(xì)胞，能夠感知和應(yīng)對炎癥和骨損傷。在單核細(xì)胞群中，研究人員鑒定出了兩個單核細(xì)胞群、三個巨噬細(xì)胞群、一個OCs群和DCs細(xì)胞群（圖4A），并根據(jù)標(biāo)記基因?qū)@些細(xì)胞群進行注釋（圖4B）。與HC組相比，PD組的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，但在牙周初始治療后有所減少（圖4C）。說明初始牙周治療可以通過抑制破骨功能有效地來防止額外的骨質(zhì)流失。通過擬時間分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞類群在進化上并沒有分支（圖4D）。研究人員進一步分析了參與連續(xù)進化的基因表達模式，cluster1和cluster3的基因在破骨細(xì)胞形成過程中受到抑制，主要富集在炎癥反應(yīng)相關(guān)通路中（圖4E-F）。同時，與免疫細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如HMGB2、305 BCL6和FOS，隨著分化軌跡逐漸下調(diào)(圖4G)。相反，一些破骨細(xì)胞相關(guān)因子，如NFATC1、JUN、MAFB、JDP2在此過程中上調(diào)(圖4G)。此外，IL1B和CCL20在巨噬細(xì)胞中表達量高，而在破骨細(xì)胞生成中表達量降低(圖4H)。
6. 內(nèi)皮細(xì)胞
由于炎癥浸潤增強，牙周病變中可見大量內(nèi)皮細(xì)胞(圖1D)。研究人員從4461個內(nèi)皮細(xì)胞中鑒定了10個不同類型的內(nèi)皮細(xì)胞群(圖5A)。靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和動脈內(nèi)皮細(xì)胞的相對百分比在PD組高于HC組，而PDT組與PD組相比沒有顯著差異。PD組的淋巴ECs也有類似的變化情況，盡管并沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(圖5A-C)。研究人員還對ECs中的轉(zhuǎn)錄因子進行了分析（圖5D-E），發(fā)現(xiàn)SOX17和TEAD3可能參與體內(nèi)平衡和炎癥條件下動脈再生，可能與牙周微環(huán)境中動脈ECs的改變相關(guān)。差異分析發(fā)現(xiàn)，在PD vs HC，PDT vs PD 以及PDT vs PD這幾種情況下，CSF3都處于上調(diào)狀態(tài)（圖5F）。
7. T細(xì)胞和B細(xì)胞在牙周組織微環(huán)境中的異質(zhì)性
免疫細(xì)胞是慢性炎癥的重要調(diào)節(jié)因子，于是研究人員最后對免疫細(xì)胞這一類群進行的探究，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞以及漿細(xì)胞（圖6A）。首先是對這些亞群進行分群聚類和標(biāo)記基因注釋（圖6B），從中識別出了NKT細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞。然后又從CD4+細(xì)胞群和CD8+細(xì)胞群中分別聚類出六個CD4+系細(xì)胞亞群和七個CD8+系細(xì)胞亞群（圖6C-D）。之后便是富集分析，比較了不同組別樣本之間富集通路的差異（圖6E），此外，還在CD8+細(xì)胞亞群中檢測到了關(guān)鍵免疫檢查點基因（圖6F）。分析完T細(xì)胞，研究人員又對B細(xì)胞也進行了一系列分析（圖6G-J），包括分群、注釋以及富集分析等。
8. 細(xì)胞通訊
逐一對所關(guān)注的細(xì)胞類群進行分析后，研究人員還進行了細(xì)胞通訊分析（圖7），因為研究骨細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用有助于進一步了解牙周炎的發(fā)病機制。因此他們采用CellPhoneDB識別主要細(xì)胞類型中的受體-配體對，共識在HC、PD和PDT組的樣本中鑒定了91699對配體-受體相互作用對。
正如圖8所示，牙周治療后牙周組織中骨免疫細(xì)胞之間存在相互作用調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。
小結(jié)
本文主要是通過單細(xì)胞測序技術(shù)從單細(xì)胞層面對牙周炎免疫微環(huán)境中不同類型的細(xì)胞類群逐一進行分析。整體思路比較簡單，概括來說就是分群，注釋，然后是對注釋完的細(xì)胞亞群進行再聚類和分析，最后是對不同類型的細(xì)胞進行了細(xì)胞通訊分析。當(dāng)然，這篇文章并不是純數(shù)據(jù)分析，其中也做流式和熒光染色等這些實驗。但是其中對于單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的思路也是值得我門借鑒的。
參考文獻
Yue Chen, Hua Wang, Wen Sun. Single-cell RNA landscape of the osteoimmunology microenvironment in periodontitis.
