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2018年，來自德克薩斯大學的研究者詹姆斯·艾利森（James P.Allison）和日本京都大學的本庶佑（Tasuku Honjo）兩位科學家因為“發現抑制負向免疫調節的新型癌癥療法”獲得了諾貝爾醫學和生理學獎。也就是在同一年，代表性的免疫檢查點抑制劑：PD-1單抗，正式被批準在國內上市。病人常常將以PD-1單抗為代表的藥物稱為“免疫治療藥物”。PD-1單抗在國外的上市時間是2014年，因此，在2014年之后的4年，這個藥物被蒙上了神秘的面紗，被稱之為“神藥”。那么，PD-1單抗到底是不是“神藥”？它的作用原理又如何呢？首先研究人員需要知道的是，“腫瘤免疫治療”是一大類的治療手段。其中一個重要的組成部分是“免疫檢查點抑制劑”，而PD-1單抗，正是免疫檢查點抑制劑的一種。因此，PD-1單抗并不是“腫瘤免疫治療”的全部。腫瘤細胞為了逃脫免疫細胞的殺傷，會采用許多種方式。其中有一種方式，就是利用“免疫檢查點”。免疫檢查點分子類似于免疫細胞的“剎車”。腫瘤細胞十分“狡猾”，往往在其細胞表面，高表達“剎車”分子的配體。這就相當于，踩住了“剎車”，使免疫細胞失去了殺傷腫瘤的能力。在這些“剎車分子”中，PD-L1就是最主要的一種。后續幾年的研究中也有大量的研究關于免疫檢查點及其抑制劑，今天小編為大家帶來一篇十月分《cancer cell》上的一篇關于單細胞分析揭示了三陰性乳腺癌(TNBC)中與PD-L1阻斷反應相關的關鍵免疫細胞亞群,將免疫檢查點抑制劑與免疫細胞、癌癥腫瘤亞群關聯分析，能為你的研究提供哪些思路呢？
摘要：
在三陰性乳腺癌(TNBC)中，聯合化療和檢查點抑制劑的好處還不是很清楚。研究人員利用單細胞RNA和ATAC測序來檢測22例接受紫杉醇或其聯合抗pd - l1 “atezolizumab”治療的晚期TNBC患者的免疫細胞。研究人員證明，高水平的基線CXCL13+ T細胞與巨噬細胞的促炎特征有關，可以預測對聯合治療的有效反應。在應答患者中，淋巴組織誘導細胞(LTi)、濾泡B (Bfoc)細胞、CXCL13+ T細胞和傳統的Ⅰ型樹突狀細胞(cDC1)在聯合治療后一致增加，而紫杉醇單藥治療后相反減少。研究人員的數據強調了CXCL13+ T細胞對抗pd - l1治療有效應答的重要性，并提示紫杉醇方案減少CXCL13+ T細胞可能會影響atezolizumab聯合TNBC治療的臨床結果。
文章亮點：
1.在抗pd - l1治療后TNBC中發現動態免疫細胞改變
2.CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T細胞可以預測PD-L1阻斷有效反應
3.發現表達CXCL9的促炎巨噬細胞與CXCL13+ T細胞相關
4.發現紫杉醇損害由atezolizumab引起的應答免疫細胞的擴張
結果：
晚期TNBC患者的免疫細胞動力學
圖S1
圖S2
研究人員將22例晚期TNBC患者納入本研究，其中半數采用紫杉醇單藥治療，另一半采用紫杉醇加atezolizumab作為一線治療。免疫治療應答者表現出了水平更高的TILs和PD-L1，但并非所有具有這些特征的腫瘤都對抗PD-L1治療有反應(圖S1A)，表明有必要解剖免疫治療的機制。因此，研究人員采用單細胞測序來描述TNBC患者的免疫特征和動態，顯示出不同的臨床結果。在基線、治療開始后4周和疾病進展時共采集了78例腫瘤活檢和血液樣本(圖S2A)。研究人員對活檢樣本進行了外顯子組測序，發現它們的基因組改變與癌癥基因組圖譜(TCGA)中人類乳腺腫瘤中常見的發現一致。經過高質量的篩選，研究人員獲得了489,490個高質量免疫細胞的單細胞轉錄組數據，包括髓系細胞、固有淋巴細胞(ILCs)、T細胞和B細胞(圖S2B、S1C和S1D)。在聯合治療組中，B細胞在應答性腫瘤中主要富集，而髓細胞在非應答性腫瘤中富集(圖S1E)。治療后主要免疫細胞類型的動態變化，兩組有效治療后B細胞減少，T細胞增加。
研究人員建立了兩個指標，預測指數(Pi)和治療指數(Ti)，以系統地研究不同的免疫細胞類型與臨床反應的關系。Pi測量基線細胞比例與腫瘤大小變化之間的相關性，Ti測量細胞比例動態與腫瘤大小變化之間的相關性。Pi或Ti陽性表示基線水平較高或相應免疫細胞亞型的細胞比例增加與治療后腫瘤大小的更大程度的減小相關，因此分別預測或介導了有利的反應。Pi陰性或Ti陰性分別表示對應的免疫細胞亞型預測或介導不利反應。
基于Pi分析，研究人員發現B細胞是最顯著的免疫細胞類型，可以預測對兩種治療方案的良好反應(圖S2C和S1F)，這與關于B細胞對ICB反應的預測作用的發現相一致。在Ti分析中，與化療相比，T細胞在聯合治療中明顯表現出Ti陽性(圖S2C和S1F)，這表明atezolizumab可能通過提高T細胞水平來促進有效反應。
為了在人類TNBC中生成一個完整的免疫細胞圖譜，研究人員進一步對來自血液或腫瘤的每個主要免疫腔室分別重新聚類。研究人員發現了具有獨特分子特征的異質免疫細胞亞型，表明了它們獨特的細胞身份(圖S2B、S2D和S1G)。
圖1
圖2
CD8-CXCL13和CD4-CXCL13在聯合治療的TNBC腫瘤中擴增
研究人員上述的分析表明，T細胞可能在PD-L1阻斷治療中發揮核心作用。基于研究人員在TNBC腫瘤中的高分辨率T細胞圖，研究人員發現了兩個高表達PDCD1和CXCL13的T細胞簇(CD8-CXCL13, CD4-CXCL13);三個T細胞群包括naive (Tn)、activated (Tact)和proliferative (Tprf)亞群，其中包含CD8+和CD4+ T細胞;以及一些典型的CD8+或CD4+ T細胞簇，包括調節性(Treg)、中央記憶(Tcm)、效應性(Teff)、效應性記憶(Tem)、組織常駐記憶(Trm)和黏膜相關不變T (MAIT)細胞亞群(圖1A和1B)。
除了淋巴結(LNs)中富集的Tn和肝轉移部位富集的MAIT外，這些T細胞亞群沒有顯示出特定的組織偏好(圖1C)。值得注意的是，CD8-CXCL13表達TIGIT、CTLA4和LAG3的T細胞耗竭相關基因，而CD4-CXCL13通過表達BHLHE40、TOX2和CXCR5，不僅表現出T輔助型1 (Th1)細胞和T濾泡輔助型(Tfh)細胞的特征，也表達了耗盡標志物(圖2A)。CD8-CXCL13和CD4-CXCL13的衰竭特征暗示了它們的腫瘤反應性，因為此前的研究表明，腫瘤反應性T細胞由于持續的腫瘤抗原刺激而表現出衰竭表型。此外，基于匹配的T細胞受體(TCR)數據，這兩個亞群與T調節細胞(treg)一起，顯示出顯著的克隆擴增，進一步表明它們的抗原體驗特性(圖1A)。
為了解釋治療后的免疫細胞動力學，研究人員首先研究了紫杉醇對不同T細胞亞群的調節。與無應答者相比，應答者在紫杉醇治療后CD8- cxcl13、CD4- cxcl13和Tregs水平降低，CD8+ Tem、Teff和CD4+ Tcm細胞水平升高(圖2B、2C和S2D)。有趣的是，CD8-CXCL13和CD4-CXCL13在紫杉醇+ atezolizumab治療后的應答患者中均擴增，導致聯合治療組中CD8-CXCL13的比例高于單獨紫杉醇治療后的比例(圖2B, 2C和S2E)。同樣，研究人員的Ti分析也顯示，在反應性患者中，聯合治療后CD8-CXCL13和CD4- CXCL13的表達增加，而紫杉醇治療后則減少(圖2D和1F)。這些觀察結果提示CXCL13+ T細胞與PD-L1阻斷的相關性。研究人員進一步利用TCR序列來追蹤對聯合治療反應的腫瘤中CXCL13+ T細胞的譜系起源，發現它們的擴增既包含已存在的克隆，也包含新浸潤的克隆(圖2E和2F)。事實上，考慮克隆TCRs(克隆大小R2)時，已有克隆的數量大于新滲透克隆。因此，在治療后，大量已經存在的克隆有助于CXCL13+ T細胞的擴展。在BC小鼠模型中，ICB治療后CD8+ PD-1+ LAG3+ T細胞增加，進一步證實了CD8- cxcl13與ICB治療的相關性。此外，ICB治療后，CD8+耗盡T (Tex)細胞的數量增加(圖1G和1H)也證實了人類基底細胞癌(BCC)的單細胞數據。
圖4
CXCL13+ T細胞和相關B細胞可以預測抗pd - l1免疫治療的良好反應
與聯合治療的耐藥患者相比，應答患者表現出更高的基線CD8- CXCL13和CD4-CXCL13水平(圖2B和2C)，這表明CXCL13+ T細胞在形成抗pd - l1治療的臨床結果中具有重要意義。一致地，研究人員的Pi分析也表明，較高水平的CXCL13+ T細胞可以預測對聯合治療更好的反應(圖2D)。除了CXCL13+ T細胞，Tn-LEF1盡管在LNs中特異性富集，但也與兩種治療方案的良好反應有關(圖2D)。基于tcga的分析顯示，與黑色素瘤和肺腫瘤相比，乳腺腫瘤含有更少的浸潤性CD8+ CXCL13+ T細胞(圖1I)，這與ICB治療BC的低應答率一致。研究人員通過多色免疫組化(IHC)染色進一步證實了CD8- CXCL13和CD4-CXCL13 T細胞在聯合治療反應的腫瘤中存在(圖3A)。TNBC腫瘤中的B細胞包括兩個主要的亞群：CD19+ B和血漿B (pB)細胞(圖4A)，在聯合治療組中，有應答者的基線CD19+ B細胞水平高于無應答者(圖4B)。CD19+ B細胞高度表達CXCL13的受體CXCR5 (BCA-1)(圖4A)，表明它們與CXCL13+ T細胞有潛在的聯系。的確，在紫杉醇+ atezolizumab應答的TNBC腫瘤中，研究人員觀察到CD19+ B細胞與CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T細胞共定位(圖3A)。淋巴細胞聚集表明，這種定位與三級淋巴樣結構(TLS)高度相似，這與最近的研究一致，表明TLS有助于免疫治療反應。
此外，研究人員發現，在人BCC患者進行ICB治療后，CD19+ B細胞與CD8+ Tex細胞共同擴增(圖1H) 。與CD8+ CXCL13+ T細胞稀少的TCGA BRCA腫瘤相比，大量CD8+ CXCL13+ T細胞的TCGA BRCA腫瘤中，含有CD79A和CD19的B細胞制造者以及CXCR5的高表達(圖4C)。通過比較應答性和非應答性腫瘤中B細胞的轉錄組差異，研究人員發現應答性腫瘤中富含高表達基因的B細胞參與了抗原處理和呈遞、干擾素(IFN)-g應答和T細胞激活的通路。相比之下，在無應答的腫瘤高表達基因中富集的B細胞參與了B細胞激活、免疫球蛋白的產生和體液免疫應答的通路(圖3B和4D)。因此，B細胞在抗腫瘤免疫中的作用可能主要是激活CXCL13+T細胞。
聯合治療后，Bfoc和LTi細胞在TNBC腫瘤中一致擴增
圖5
研究人員發現CD19+ B細胞由naive B (Bn)、memory B (Bmem)、Bfoc、增殖Bmem和增殖Bfoc亞群組成，這些亞群沒有顯示出特定的組織富集(圖4A、4E和4F)。值得注意的是，Bn、Bmem和Bfoc細胞主要富集在紫杉醇+ atezolizumab應答的腫瘤中，而在紫杉醇應答的腫瘤中不富集(圖5C和4G)。Bfoc細胞的特征是MEF2B、BCL6、RGS13和NEIL1的高表達(圖4A和4E) 。在兩組治療中，有應答者的基線Bfoc水平明顯高于無應答者(圖5C和4G)，研究人員的Pi分析也顯示了Bfoc與良好的臨床反應之間的聯系(圖5D)。對于B細胞動力學，研究人員發現紫杉醇治療應答者的Bfoc降低，而紫杉醇加atezolizumab治療應答者的Bfoc增加(圖5C、5D和4G、4I)，這表明Bfoc細胞與atezolizumab治療的相關性。重要的是，研究人員描述了不同B細胞亞群的預后意義，并揭示了Bfoc是與BRCA合并TCGA患者的良好臨床結局相關的最顯著的B細胞亞型(圖5E)。因此，Bfoc似乎是對患者生存和icb免疫治療最重要的B細胞亞群。
接下來研究人員研究了Bfoc與其他免疫細胞的聯系。通過描述相關的免疫細胞亞型，研究人員發現CD4-CXCL13和CD8-CXCL13在細胞比例上與Bfoc高度相關，特別是在治療后組(圖5F和4J)。提示Bfoc可能與CXCL13+ T細胞相互作用，在抗腫瘤免疫中發揮作用。針對配體-受體對，研究人員發現CXCR5在Bfoc亞群中表達水平最高，cd40gl - cd40、interleukin -(IL)21-IL21R、IL6ST-EBI3等多對可能介導了Bfoc與CD4-CXCL13之間的作用(圖5G)。有趣的是，以CCR7、IL7R、GPR183、LTB (lymphoxin)、IL23R基因表達為特征的ldl -like ILC3 (ILC3-IL7R)也與Bfoc具有高度相關性，在聯合治療后與Bfoc共同擴增，而化療后則沒有(圖5H、5J、4J、4K)。值得注意的是，ILC3-IL7R可以預測兩種治療方案的良好反應(圖5J)，表明其在有效抗腫瘤免疫中的潛在作用。
聯合治療后，TNBC腫瘤中cDC1擴增
圖6
先前CXCL13+ T細胞在抗pd - l1治療中的重要性促使了研究人員去進一步研究CXCL13+ T細胞如何在某些TNBC患者中被激活和富集。由于TME中的髓細胞可能調節T細胞反應，研究人員接下來關注TNBC腫瘤中的髓系腔室。研究人員觀察了樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞和肥大細胞。在這些主要亞群中，研究人員觀察到有應答者的DCs水平高于無應答者，無論是在基線時還是在聯合治療而非化療后(圖6A)，這支持了它們在ICB治療中的作用。
為了確定TNBC腫瘤中DCs的特定亞群，研究人員進行了無監督聚類，識別了漿細胞樣DC (pDC)、cDC1、成熟DC (mDC，或LAMP3+ DC)，包括CCR7、LAMP3、CCL19、IDO1和PD-L1，以及三個常規DC2 (cDC2)亞群，包括朗格罕細胞(LCs, cDC2- cd207)、促炎和抗炎cDC2 (cDC2- clec10a, cDC2- fcgr2b)，基于其特征基因(圖S4B S4D;表S2)。有趣的是，較高的基線cDC1和pDC水平可能提示紫杉醇治療有良好的反應，但這些DC亞群中沒有一個可以表明聯合治療有良好的反應，這可能暗示DC亞群不是有效抗pd - l1治療的關鍵決定因素。
對于不同的DC子集，研究人員接下來檢查了它們在不同治療組中的時間動態。與無應答者相比，應答者在紫杉醇治療后顯示mDC水平下降，這一時間模式類似于同一治療組中潛在的腫瘤反應性T細胞(圖2C和6B)。
“RNA豐度是單個細胞狀態的有力指標。單細胞RNA測序可以定量、準確、靈敏、高通量地揭示RNA豐度。然而，這種方法只能在某個時間點捕獲靜態快照，這對分析胚胎發生或組織再生等隨時間變化的現象提出了挑戰。在這里，證明了RNA速度——基因表達狀態的時間導數——可以通過區分普通單細胞RNA測序中未剪接和剪接的mrna來直接估計。RNA速率是一種高維的載體，可以在數小時的時間尺度上預測單個細胞的未來狀態。在神經嵴譜系中驗證了它的準確性，展示了它在多個已發表的數據集和技術平臺上的應用，揭示了發育中的小鼠海馬的分支譜系樹，并檢測了人類胚胎大腦中的轉錄動力學。”
盡管根據RNA速度分析，cDC1和促炎cDC2均可轉化為mDC，這與人類肝癌和肺癌的研究結果一致；在TNBC腫瘤中，mDC與cDC1緊密連接，這是由于它們的轉錄相似性和細胞比例的動態變化相關(圖6C和6D)。對于紫杉醇+ atezolizumab治療的患者，研究人員還觀察到，與cDC1和pDC的增加相比，應答者治療后mDC減少，這可能是由于紫杉醇方案選擇性減少了mDC(圖6B)。重要的是，與紫杉醇單獨治療相比，紫杉醇聯合atezolizumab治療應答患者后發現更高水平的cDC1、mDC和pDC，表明它們參與了抗pd - l1治療。
研究人員的Ti分析進一步表明，cDC1和pDC與聯合治療的良好反應有關，而與化療無關(圖6E)。值得注意的是，同時使用atezolizumab時，紫杉醇治療后mDC的減少被抑制，這表明它與PD-L1阻斷有關。值得注意的是，mDC和cDC1都表現出與CD4-CXCL13協調的時間動態(圖6D)，研究人員通過TCGA BRCA的bulk RNA-seq數據證實了它們的相關性(圖6F)。此外，研究人員還發現了多種配體-受體對，包括CD40LG-CD40，它們可能介導了mDC、cDC1和CD4-CXCL13之間的串擾(圖6G)。有趣的是，根據細胞比例中mDC、cDC1和CD4-CXCL13的時間動態，CD8-CXCL13也顯示出高相關性(圖6D)。這些觀察表明，CD4- cxcl13和CD8- cxcl13可能同時被cDC1或mDC激活，最近的研究表明同源CD4+ T細胞許可cDC1誘導CD8+ T細胞免疫。
巨噬細胞的表型與T細胞狀態相關
針對單核細胞/巨噬細胞室，研究人員發現，與聯合治療組相比，無應答組的巨噬細胞(Mf)基線水平更高，且無應答組的巨噬細胞高表達SPP1、TREM2、FN1和C3，而應答組的巨噬細胞高表達CXCL9、MMP9、和PLA2G2D(圖6A和7A)。值得注意的是，已證明TREM2和SPP1在抗炎腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)中表達。進一步的非監督聚類顯示了廣泛的異質性，導致單核細胞和巨噬細胞的多個亞群。單核細胞亞群高表達FCN1、S100A8和S100A9，而巨噬細胞亞群高表達CD68、APOE和C1Qs，類似于tam的特征。值得注意的是，TNBC腫瘤中的巨噬細胞亞群傾向于共同表達規范M1和M2信號(圖1e)，這與最近在人類乳腺癌和肺癌中的發現一致。為了了解CXCL13+ T細胞是如何被其他免疫細胞調節的，研究人員利用TCGA BRCA數據來檢測CD8A和CXCL13高表達的乳腺腫瘤的轉錄特征。果然，一組免疫相關基因被鑒定出來(圖7B)。
為了估計伴隨有潛在腫瘤反應性T細胞的免疫細胞亞型的存在，研究人員在排除T細胞和B細胞標記后，檢測了上述基因在骨髓細胞亞群中的表達。值得注意的是，兩個巨噬細胞亞群，Mf-CCL2和Mf-MMP9，以及mDC和其他DC亞型，都是排名最高的免疫亞型(圖5C)，表明它們與CXCL13+ T細胞相關。Mf-MMP9亞群高表達PLA2G2D、IL2RG和CXCL9，而Mf-CCL2高表達CXCL9、CXCL10和CXCL11(圖7D)。CXCL9和CXCL10是已知的介導T細胞招募的趨化因子，它們在Mf-MMP9和Mf-CCL2中的高表達支持這兩個巨噬細胞亞群的促炎特性。除了上述基于轉錄組的分析，研究人員還檢測了免疫細胞比例，發現MfCCL2和Mf-MMP9也與CXCL13+ T細胞高度相關(圖7E)。值得注意的是，這兩種巨噬細胞亞群的高基線水平表明聯合治療的良好反應(圖7F)。分析顯示，Mf-CCL2和Mf-MMP9的關鍵特征基因，包括CXCL9和CXCL10，與IFNG和TNF相關(圖7G)，表明TME中積極的抗腫瘤免疫反應可能重塑了巨噬細胞的蛋白炎性表型。與無應答者相比，研究人員一致觀察到在紫杉醇加atezolizumab應答的腫瘤中Mf-MMP9和CD8-CXCL13同時富集(圖7H)。與Mf-CCL2和Mf-MMP9相比，Mf-MKI67、Mf-SLC40A1和Mf-MGP的基線水平與Tregs呈正相關，而Mf-CX3CR1、Mf-TUBA1B和Mf-FOLR2與CXCL13+ T細胞呈負相關。這些亞群高表達SPP1和TREM2，類似于研究人員之前在人類結直腸癌研究中發現的SPP1+ TAMs ，因此代表抗炎巨噬細胞。根據研究人員的Pi分析，研究人員觀察到它們在對聯合治療無反應的腫瘤中富集(圖7F)。
對于不同治療后巨噬細胞亞群的動態變化，研究人員發現紫杉醇方案選擇性地減少了Mf-CCL2和Mf-MMP9的促炎巨噬細胞，但增加了應答患者的免疫抑制巨噬細胞，而atezolizumab似乎對巨噬細胞亞群影響不大(圖7F)。這些結果表明紫杉醇可能具有免疫抑制的TME。為了促進臨床應用生物標志物的開發，研究人員通過構建評分分類器進一步評估CXCL13+ T細胞和Mf-MMP9關鍵特征基因的預測性能，發現了一組具有高預測潛力的標志物(圖7I)。因此，核心抗腫瘤免疫亞群的關鍵特征基因可以作為預測ICB反應的生物標志物。
CD8-CXCL13在抗pd - l1治療后細胞毒性增強
考慮到CXCL13+ T細胞在抗pd - l1治療中的重要性，研究人員接下來研究了其治療誘導的轉錄動態。值得注意的是，根據RNA速度和TCR共享分析，CD8- cxcl13與CD8+ Tem細胞有譜系聯系。轉錄組分析顯示IFNG、GZMK、GZMA和CD44的效應基因和記憶相關基因;TBX21、BHLHE40和BCL6的轉錄因子(TFs);CD28和ICOS共刺激分子;CD8-CXCL13治療后，HLA基因和整合素上調，而耗竭相關基因，包括HAVCR2、LAYN、TIGIT和LAG3下調(圖8A)。CD8-CXCL13表型的轉移還體現在其衰竭評分降低和效應記憶評分增加(圖8B)。此外，CD8-CXCL13治療后上調的基因參與了T細胞介導的細胞毒性、抗原加工呈提及IFN-g介導的信號通路的正調控通路，進一步說明PD-L1阻斷治療后其效應增強。
此外，研究人員還進行了單細胞ATAC-seq (scATAC-seq)檢測，以檢查染色質可及性的變化，并從5個樣本中獲得了30,758個免疫細胞的數據，包括來自紫杉醇加atezolizumab治療的應答患者的配對樣本。根據研究人員的scacac -seq和單細胞RNA-seq (scRNA-seq)數據的綜合分析確定了免疫細胞亞型。不同亞群的特征基因的染色質可及性證實了它們的細胞特性。CD8- cxcl13細胞的表觀遺傳特征與此前在小鼠模型、人類黑色素瘤和非小細胞肺癌中研究的CD8+ Tex細胞特征一致(圖8C)。與其他T細胞亞型的染色質可及性相比，CD8- cxcl13和CD8+ Tem更為相似，這證實了它們在譜系分化的連續譜中存在聯系。具體來說，CD8- cxcl13和CD8+ Tem在IFNG、GZMK和PDCD1位點上都有開放染色質區域(ocr)。然而，CD8-CXCL13表現出與CD8+ Tem不同的細胞狀態，這是因為它們在CXCL13、CTLA4和LAYN中富集了ocr(圖8C和S7G)。接下來，研究人員通過比較聯合治療前后配對的scATAC-seq數據，研究了CD8+ Tem、CD8- cxcl13和CD4-CXCL13染色質可及性的整體動態。此外，差異可達峰中TF結合motif (TFBMs)的過度表達也證實了CD8-CXCL13的表型變化，預處理組CREM和RBPJ的TFBMs趨于富集，而TBX21、EOMES和PRDM1的TFBMs在處理后組中富集(圖8E)。因此，染色質可及性動態研究的結果與基于轉錄組的分析結果一致，都支持CD8-CXCL13在聯合治療后的效應特性增強。
接下來，研究人員系統地研究了血液中的T細胞，發現在基線時應答者體內增殖的T細胞富集，但在聯合治療后降低，可能是由于紫杉醇的影響。值得注意的是，研究人員沒有在血液中觀察到CXCL13+ T細胞，但發現在聯合治療后的應答患者中，血液CD8+ Tem細胞與腫瘤CD8-CXCL13的TCR克隆水平較高，且遷移指數也較高(圖8F)。這些觀察表明，PD-L1阻斷治療后的應答患者可誘導可檢測的全身免疫應答。
文章小結：
到這里文章就結束了，研究人員利用單細胞RNA測序(RNA-seq)和ATAC測序(ATAC-seq)技術來描述22例接受紫杉醇或其聯合atezolizumab治療的TNBC患者免疫細胞的細胞和分子動力學特征，分子對接，分子動力學模擬也是生物科學課題中經常會用到的技術。研究人員發現了抗pd - l1治療的耐藥和敏感性的基礎，確定了對atezolizumab的應答免疫細胞亞型，并提出了紫杉醇聯合atezolizumab在TNBC治療中的潛在缺陷。在免疫細胞的亞型分類以及臨床免疫治療中做出了巨大推進。
