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乳腺癌是威脅女性生命安全最高的惡性腫瘤之一，而且盡管相關(guān)的治療方法日趨先進(jìn)和完善，但遠(yuǎn)期生存率仍不理想，且乳腺癌容易向身體的其他區(qū)域轉(zhuǎn)移。因此乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是延長(zhǎng)生存期的主要障礙。小編今天就和大家分享一篇今年七月剛剛發(fā)表在Nature（IF:69.504）雜志上的高分文章。文章對(duì)睡眠與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行了研究，并進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)同時(shí)結(jié)合生信分析從多個(gè)角度證明了睡眠對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移有推動(dòng)作用，文章的研究角度新穎、邏輯清晰很有啟發(fā)作用，長(zhǎng)話短說(shuō)，現(xiàn)在小編就帶大家一睹為快。
The metastatic spread of breast cancer accelerates during sleep
睡眠時(shí)乳腺癌的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散加速
一．研究背景
已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥類(lèi)型中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)都是轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)的先驅(qū)。然而，目前生理情況下調(diào)節(jié)CTC自發(fā)性?xún)?nèi)滲的因素尚不清楚，一般假設(shè)CTC是由浸潤(rùn)性癌組織不斷生成，或者由機(jī)械信號(hào)(如手術(shù))促進(jìn)生成。此外，在患者和小鼠癌癥模型中，對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)展事件的確切時(shí)間，以及決定CTC轉(zhuǎn)移傾向的機(jī)制尚不清楚。因此，更好地了解這些過(guò)程可能會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)癌癥的研究和治療。
二．文章摘要
該研究對(duì)乳腺癌患者和小鼠模型中CTC生成的動(dòng)態(tài)模式進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)自發(fā)的CTC內(nèi)滲事件發(fā)生在睡眠期間。此外，該研究證明了靜息期的CTC很容易轉(zhuǎn)移，而活躍期產(chǎn)生的CTC則缺乏轉(zhuǎn)移能力。在機(jī)制上，CTC的單細(xì)胞RNA測(cè)序分析顯示，在患者和小鼠模型中，有絲分裂基因僅在靜息期顯著上調(diào)，從而使轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。研究也發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的晝夜節(jié)律激素(如褪黑素、睪酮和糖皮質(zhì)激素)對(duì)CTC生成動(dòng)力學(xué)起決定作用，且胰島素直接促進(jìn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖，但具有時(shí)間依賴(lài)性。因此，研究認(rèn)為自發(fā)產(chǎn)生的具有高轉(zhuǎn)移傾向的CTC并非持續(xù)發(fā)生，而是集中在患者的休息階段。
三．實(shí)驗(yàn)及方法
1. 患者樣本及細(xì)胞培養(yǎng)：研究納入了乳腺癌患者休息和活動(dòng)階段的外周血樣本。研究培養(yǎng)了從1例性激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者制備的BR16細(xì)胞的CTC。研究也培養(yǎng)了人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 LM2，E0771.lmb小鼠乳腺癌細(xì)胞和4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞(ATCC)。研究后續(xù)使用攜帶GFP -熒光素酶或mCherry -熒光素酶的慢病毒轉(zhuǎn)染LM2、BR16和4T1細(xì)胞，用攜帶CD90.1的慢病毒轉(zhuǎn)染lmb細(xì)胞。
2. 鼠實(shí)驗(yàn)：研究將 LM2 - mCherry -熒光素酶細(xì)胞、BR16 - GFP -熒光素酶細(xì)胞及4T1 - GFP -熒光素酶細(xì)胞注射到8周的NSG雌性小鼠形成原位乳腺癌病灶。此外，研究也將4T1-CD90.1細(xì)胞注射于8周的BALB/c雌性小鼠，將E0771.lmb-CD90.1細(xì)胞原位注射于8周野生型大鼠或Bmal1基因敲除小鼠。接下來(lái)，分別在靜息期和活動(dòng)期抽血進(jìn)行CTC分析、器官解剖和IVIS生物發(fā)光成像。
3. 鼠的治療：研究在腫瘤發(fā)展后，用不同的晝夜調(diào)節(jié)激素治療小鼠。在腫瘤注射后10天開(kāi)始使用褪黑素，此時(shí)腫瘤開(kāi)始呈指數(shù)生長(zhǎng)，并且外周血中尚未檢測(cè)到CTC。小鼠每日接受褪黑素或與luzindole 聯(lián)合治療，Luzindole在褪黑素處理前進(jìn)行，褪黑素在靜息期(ZT :授時(shí)因子時(shí)間。ZT0:ZT0定義為早上6點(diǎn)開(kāi)燈時(shí))開(kāi)始前給藥，接著在ZT0采血并進(jìn)行CTC檢測(cè)。研究也在采血(ZT4:靜息期)前給予小鼠地塞米松，以避免下丘腦-垂體-腎上腺軸負(fù)調(diào)控環(huán)的激活。研究對(duì)腫瘤注射前4天的小鼠注射睪酮埋植劑，并保存至采血日(ZT4)。研究在腫瘤細(xì)胞注射后25天開(kāi)始胰島素處置，以避免胰島素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。小鼠在每天ZT3(ZT3：靜息期)接受胰島素與葡萄糖并行處置，在ZT4和ZT16(活動(dòng)期)進(jìn)行采血和CTC檢測(cè)，所有給藥均采用腹腔注射的方式。
4. 時(shí)差綜合征實(shí)驗(yàn)：研究在注射腫瘤1周后開(kāi)始倒時(shí)差，將動(dòng)物置于改變光周期的環(huán)境中，每2-3天提前8小時(shí)。在每個(gè)時(shí)差休息階段開(kāi)始前1.5小時(shí)，每天給有時(shí)差反應(yīng)的小鼠服用褪黑激素。靜息期開(kāi)始采血并進(jìn)行CTC分析。
5. CTC捕獲：研究對(duì)于患者樣本，采血后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行CTC捕獲。小鼠則采用心臟穿刺取血并立即處理。對(duì)于免疫功能低下的模型，樣本僅染色CD45，在免疫正常模型中，抗CD45染色與CD90.1染色同時(shí)進(jìn)行，分別識(shí)別白細(xì)胞和癌細(xì)胞。測(cè)定捕獲的CTC數(shù)量包括單個(gè)CTC、CTC簇和CTC - WBC簇。
6. 直接轉(zhuǎn)移測(cè)定:研究利用自動(dòng)單細(xì)胞收集系統(tǒng)(ALS) CellCelector對(duì)單個(gè)CTC、CTC簇和CTC - WBC簇進(jìn)行操作，然后將每個(gè)類(lèi)別的CTC注入受體NSG小鼠的尾靜脈。利用IVIS生物發(fā)光系統(tǒng)每周無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和生長(zhǎng)速度。
7. 免疫熒光染色和共聚焦分析及流式細(xì)胞術(shù):研究對(duì)解剖的器官和原發(fā)腫瘤進(jìn)行免疫熒光染色和共聚焦分析，小鼠腫瘤被切碎成碎片后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。
8. ScRNA-seq:研究將收集的單個(gè)CTC、CTC簇和CTC -WBC簇轉(zhuǎn)入含有裂解液和抑制劑的單個(gè)試管中。并按照Smart-seq2方案制備擴(kuò)增cDNA。使用Nextera XT (Illumina)制備文庫(kù)，在Illumina NextSeq500測(cè)序儀上以75-堿基對(duì)單讀模式進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本的中位原始測(cè)序深度為164萬(wàn)讀數(shù)。
9. RNA-seq分析：研究對(duì)測(cè)序讀數(shù)用Trim Galore進(jìn)行了修整，采用FastQC對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用STAR和GENCODE注釋并將修剪后的讀數(shù)與人類(lèi)基因組參考序列進(jìn)行比對(duì)。研究也對(duì)小鼠RNA的殘留污染進(jìn)行了消除。讀數(shù)計(jì)數(shù)使用R/Bioconductor中的edgeR包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并利用R/Bioconductor中的scater包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和可視化處理。標(biāo)準(zhǔn)化后，根據(jù)scran的getTopHVGs函數(shù)，使用生物成分最大的前500個(gè)基因的基因表達(dá)進(jìn)行主成分分析。
10. 差異表達(dá)及GSEA: 研究利用 R/Bioconductor中的edgeR包計(jì)算差異表達(dá)，并利用Benjamini-Hochberg方法對(duì)P值進(jìn)行了校正。使用R/Bioconductor中的clusterProfiler包進(jìn)行GSEA。
四．主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 晝夜節(jié)律和CTC內(nèi)滲
在文章第一部分，作者首先試圖確定在同一天的活動(dòng)和休息的進(jìn)展期乳腺患者的CTC豐度和組成。研究共納入30例患者(圖1a)，其中21例患者在采血時(shí)被診斷為早期乳腺癌，9例被診斷為ⅳ期轉(zhuǎn)移性乳腺癌。作者在休息階段的夜間采集樣本中發(fā)現(xiàn)了大量CTC，包括單個(gè)CTC、CTC簇和CTC -WBC簇(圖1a)。接下來(lái)為了檢驗(yàn)這一發(fā)現(xiàn)的普遍性，并確定事件發(fā)生的精確時(shí)間，作者使用4種不同的乳腺癌小鼠模型移植乳腺癌細(xì)胞，并在腫瘤生長(zhǎng)后，通過(guò)末端血液采樣和CTC捕獲來(lái)檢測(cè)隨時(shí)間推移自發(fā)產(chǎn)生的CTC。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與患者數(shù)據(jù)一致，大多數(shù)CTC事件出現(xiàn)在小鼠休息期樣本中(圖1b,c)。作者進(jìn)一步當(dāng)以每4小時(shí)為間隔對(duì)24小時(shí)進(jìn)行時(shí)間動(dòng)力學(xué)分析時(shí)，觀察到CTC釋放的振蕩模式非常明顯(圖1b)。當(dāng)聚焦于小鼠晝夜節(jié)律的靜止期(ZT4)和活動(dòng)期(ZT16)兩個(gè)最具代表性的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，研究觀察到在所有測(cè)試的模型中，CTC的絕對(duì)計(jì)數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)均有顯著差異(圖1c)。鑒于這些結(jié)果，作者得出結(jié)論，靜息期和活動(dòng)期觀察到的CTC豐度的主要差異歸因于內(nèi)滲率的差異。接下來(lái)作者嘗試用不同的方法打亂小鼠的生理節(jié)律，一方面改變正常的光暗(LD)周期，從而引發(fā)時(shí)差效應(yīng)，另一方面，使用褪黑激素對(duì)對(duì)照組和有時(shí)差反應(yīng)的小鼠進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照小鼠相比，時(shí)差誘導(dǎo)導(dǎo)致CTC減少。此外，作者也發(fā)現(xiàn)，褪黑素誘導(dǎo)會(huì)增加CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的產(chǎn)生，褪黑素受體拮抗劑luzindole則會(huì)干預(yù)這些情況，也就是說(shuō)褪黑素可增加CTC生成，而luzindole可在不影響原發(fā)腫瘤大小的情況下減少CTC生成。然后，作者也觀察到，在各種光照條件下，CTC數(shù)量在靜息期均持續(xù)增加，這表明光照在CTC內(nèi)滲中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最后，考慮到CTC內(nèi)滲的振蕩模式及其與晝夜節(jié)律的關(guān)系，作者測(cè)試這些模式是否在基因敲除小鼠中被消除，研究使用野生型BL/6小鼠(BL/6-E0771.lmb)和Bmal1純合子敲除小鼠(BL/6- Bmal1?/?-E0771.lmb)(圖1d)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照BL/6-E0771的CTC計(jì)數(shù)在心臟穿刺和腫瘤引流管（ tumour draining vessel，TDV）中都遵循一種典型的振蕩模式。在lmb小鼠中，CTC計(jì)數(shù)的振蕩在BL/6-Bmal1?/?E0771中消失。綜上所述，這些結(jié)果表明在乳腺癌患者和小鼠模型中，單個(gè)和集群CTC的釋放都是在睡眠期間實(shí)現(xiàn)的。
2. CTCs在睡眠時(shí)的轉(zhuǎn)移能力
在文章的第二部分作者研究了晝夜節(jié)律的不同階段產(chǎn)生的CTC是否具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。作者使用GFP或RFP標(biāo)記的NSG-LM2異種移植模型，在腫瘤發(fā)生后分離出ZT4 (GFP標(biāo)記)和ZT16 (RFP標(biāo)記)自發(fā)脫落的CTC，最終分離出150個(gè)ZT4產(chǎn)生的GFP標(biāo)記的CTC和150個(gè)ZT16產(chǎn)生的RFP標(biāo)記的CTC，每個(gè)CTC都由110個(gè)單個(gè)CTC、35個(gè)CTC簇和5個(gè)CTC -WBC簇組成，接著作者在晝夜節(jié)律的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行無(wú)腫瘤受體小鼠的尾靜脈注射來(lái)測(cè)量這些CTC的直接轉(zhuǎn)移能力(圖2a)。結(jié)果通過(guò)體內(nèi)生物發(fā)光成像，作者發(fā)現(xiàn)在靜息期，尤其是ZT4的轉(zhuǎn)移負(fù)荷最高(圖2b)。接著為了分析這些轉(zhuǎn)移灶是否來(lái)源于ZT4或ZT16 CTC，作者使用抗GFP和抗RFP抗體進(jìn)行了免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)移來(lái)自ZT4產(chǎn)生的GFP標(biāo)記的CTC(圖2c)。這些結(jié)果表明ZT4 CTC對(duì)轉(zhuǎn)移灶的形成具有重要作用，并且在靜息期注射ZT4 CTC更容易形成轉(zhuǎn)移灶。接下來(lái)，作者試圖將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到更多的模型并精確量化靜息期與活動(dòng)期單個(gè)CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的轉(zhuǎn)移能力，因此作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2異種移植模型，在腫瘤發(fā)生后，捕獲分離自發(fā)脫落的CTC。然后，分離出單個(gè)CTC、CTC簇的CTC和CTC - WBC簇的CTC，這些CTC分別處于靜息期(ZT4)和活動(dòng)期(ZT16)，接著作者在(ZT12:定義為下午6點(diǎn)熄燈)通過(guò)無(wú)腫瘤受體小鼠的尾靜脈注射這些CTC，來(lái)測(cè)定其直接轉(zhuǎn)移能力(圖2d)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ZT16期間獲得的CTC相比，ZT4期間獲得的CTC表現(xiàn)出更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力(圖2e)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)，與活動(dòng)期的CTC相比，靜息CTC簇和CTC - WBC簇似乎具有比單個(gè)CTC更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移形成特征(圖2e)。總之，這些結(jié)果表明， 靜息期不僅CTC內(nèi)滲率增加，而且它們的轉(zhuǎn)移能力也會(huì)增強(qiáng)。
3. CTC基因表達(dá)的時(shí)間依賴(lài)性
接下來(lái)，在文章的第三部分作者試圖研究CTCs在靜止期和活動(dòng)期轉(zhuǎn)移能力差異的分子特征。作者在小鼠晝夜節(jié)律的休息(ZT4)和活動(dòng)(ZT16)階段分離出單個(gè)CTC, CTC簇和CTC - WBC簇，并分別對(duì)它們進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq;圖3 a)。在篩選了高質(zhì)量樣本后，作者從NSG-CDX-BR16模型中獲得了138個(gè)CTCs，從NSG-LM2模型中獲得了108個(gè)CTCs，代表了ZT4和ZT16的所有類(lèi)型CTC。使用主成分分析，作者發(fā)現(xiàn)時(shí)間點(diǎn)(ZT4 . ZT16)是驅(qū)動(dòng)CTC基因表達(dá)變化的關(guān)鍵特征(圖3b)。在靜息期(ZT4)和活動(dòng)期(ZT16)分離的樣本中，差異基因表達(dá)顯示ZT4 CTC中有121個(gè)上調(diào)基因，ZT16 CTC中有156個(gè)上調(diào)基因，作者也觀察到，大多數(shù)定義ZT4和ZT16表達(dá)特征的基因在所有類(lèi)型的CTC中都被一致地高度上調(diào)，但在CTC簇和CTC -WBC簇中統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性最高。這與單細(xì)胞樣本中預(yù)期的較高變異性和較高脫落率一致。對(duì)ZT4和ZT16期間上調(diào)基因的基因集富集分析(GSEA)也發(fā)現(xiàn)ZT4期間支持有絲分裂和細(xì)胞分裂的通路具有高度一致的活性，而ZT16期間則富集到支持核糖體生物發(fā)生和基因翻譯的通路。此外，在從乳腺癌患者在同一天活動(dòng)期和休息期分離的人類(lèi)CTC中，作者發(fā)現(xiàn)了與在小鼠模型中觀察到的相同的基因表達(dá)模式和通路活性(圖3f)，且在靜止期和活動(dòng)期的不同時(shí)間點(diǎn)也一致(圖3g)。考慮到CTC的半衰期短，作者推斷原發(fā)腫瘤也可以看到細(xì)胞增殖的振蕩變化。因此，作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2模型對(duì)增殖標(biāo)志物Ki67及其CTC進(jìn)行染色時(shí)，發(fā)現(xiàn)Ki67在靜息期顯著上調(diào)(圖3h)。總之，從患者和小鼠模型中分離出的CTC的分子基因表達(dá)分析展示了非常不同的基因表達(dá)模式。在睡眠期間，基因表達(dá)由細(xì)胞分裂和有絲分裂基因主導(dǎo)，而在活動(dòng)期，則觀察到高核糖體生物發(fā)生活動(dòng)。這種振蕩增殖時(shí)間不僅在CTC中觀察到，而且在原發(fā)腫瘤中也觀察到，這表明這是在疾病進(jìn)展期間發(fā)生在乳腺癌細(xì)胞中的普遍現(xiàn)象。
4. CTC內(nèi)滲的調(diào)控因子
在文章的最后一部分，作者對(duì)晝夜節(jié)律驅(qū)動(dòng)的CTC生成和增殖的主要調(diào)節(jié)因子的機(jī)制進(jìn)行了研究。作者分析了來(lái)自異種移植物和患者CTC的RNA-seq數(shù)據(jù)，以確定晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)激素、生長(zhǎng)因子或分子的受體表達(dá)水平，評(píng)估了受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的候選受體表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體、雄激素受體和胰島素受體的表達(dá)在單個(gè)CTC、CTC簇和CTC - WBC簇中高度出現(xiàn)，這表明它們的配體參與了時(shí)間點(diǎn)驅(qū)動(dòng)的CTC生成和增殖(圖4a)。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，作者首先用地塞米松或睪酮治療荷瘤小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜息期地塞米松單次治療(ZT2)和睪酮顆粒植入均導(dǎo)致靜息期峰值時(shí)間采樣時(shí)單個(gè)CTC、CTC簇和CTC - WBC簇顯著減少(圖4b,c)，且地塞米松或睪酮治療不影響原發(fā)腫瘤的大小，但觀察到睪酮治療小鼠的轉(zhuǎn)移負(fù)荷降低。此外，考慮到胰島素刺激與隨后的細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂之間的聯(lián)系，作者研究了胰島素是否也會(huì)影響乳腺癌細(xì)胞的增殖時(shí)間和內(nèi)滲。作者每日在ZT3(靜息期)用胰島素和葡萄糖治療荷瘤小鼠1周，并分別定量靜息期和活動(dòng)期的CTC豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜息期胰島素治療降低了ZT4的CTC內(nèi)滲，增加了ZT16的CTC內(nèi)滲(圖4d)，而原發(fā)腫瘤體積沒(méi)有顯著變化。作者也發(fā)現(xiàn)在靜息期使用胰島素治療也會(huì)逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的增殖周期(圖4 e)。總之，這些研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞的增殖和內(nèi)滲是由關(guān)鍵的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)激素的每日波動(dòng)決定的，這些激素的作用影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了。文章聚焦于睡眠與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)合大量實(shí)驗(yàn)與生信分析，證明靜息期CTC的內(nèi)滲及轉(zhuǎn)移能力會(huì)增強(qiáng)，并對(duì)這一現(xiàn)象的機(jī)制進(jìn)行了分析。文章邏輯清晰，角度新穎，有理有據(jù)，為有轉(zhuǎn)移傾向癌癥的時(shí)間控制性研究和治療提供了新的理論基礎(chǔ)。
