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Morning！美好的一天又開始啦~~~今天小編為大家帶來的是九月份發表在NATURE(IF=49.962)雜志上的一篇文章，作者利用單細胞測序、空間轉錄組學、流式細胞術等等，全面繪制了人類腸道的細胞譜系。
Cells of the human intestinal tract mapped across space and time
跨越時空的人類腸道細胞圖譜
數據
本研究共涉及164個10x Genomics scRNAseq樣本， 3個10x Visium樣本，包含十二指腸、空腸 (JEJ)、回腸、闌尾 (APD)、盲腸 (CAE)、升結腸(ACL)、橫結腸 (TCL)、降結腸 (DCL)、乙狀結腸 (SCL)、直腸 ( REC)和腸系膜淋巴結 (mLN)等11個不同區域。表達及原始測序數據都可通過原文提供的鏈接獲取。
技術方法
分別從胎兒和成人組織中分離出腸道細胞，利用磁性活化細胞分選法（MACS）進行收集； 將來自兒童患者的腸道類器官在基質凝膠中培養，用于RNA的提取，RNA的提取、逆轉錄和定量PCR；10x Genomics Chromium GEX文庫制備和測序；基于5′ 10x Genomics Chromium cDNA文庫制備10x Genomics V(D)J文庫；基于Plate的Smart-seq2；10x Genomics scRNA-seq數據的預處理以及質控（擴圖1.b）；對細胞譜系亞聚類并注釋細胞類型和狀態；細胞類型評分；腸道類器官分析；Smart-seq2測序數據的預處理與分析；對BEST4細胞的豐度差異分析；RNA速率和偽時序分析；單細胞BCR分析；細胞通訊分析；腸神經系統疾病相關基因的表達分析；利用多元數據的細胞類型組成分析；炎性腸病全基因組關聯研究（IBD-GWAS）基因的細胞類型富集分析；10x Genomics Visium空間轉錄組樣本的制備和數據處理；使用cell2location對細胞類型進行空間映射；冷凍切片，單分子熒光原位雜交和共聚焦成像；流式細胞術驗證小鼠簇狀細胞中的Fcgr。研究用到的所有軟件和代碼也都可以通過文章提供的鏈接獲取到。
研究結果
人類腸道細胞的整合圖譜
研究對妊娠中期和成人腸道以及腸系膜淋巴結（mLN）的不同組織區域做了scRNA-seq，并整合了妊娠早期腸道、兒童克羅恩病和健康回腸組織的scRNA-seq分析結果（圖1.a）。數據集包含共428,000多個高質量細胞，Leiden聚類和marker-gene分析揭示了不同階段的腸道中上皮細胞、內皮細胞、免疫細胞等的比例，結果表明胎兒腸道樣本富含間充質細胞和神經細胞，從妊娠中期開始，免疫細胞豐度增加（圖1.b，擴圖1.c-f）。
對細胞譜系的亞聚類分析，進一步識別出133種細胞類型和狀態，其標記基因的表達如擴圖2所示。
腸道中被報道過的BEST4上皮細胞，在不同區域的豐度也不同（圖1.c-d）。差異細胞類型豐度分析揭示了它們的區域特異性表達特征（圖1.e，擴展圖3.a-d）。 其中，小腸BEST4細胞高表達CFTR 基因（圖1.e）；化學染色后發現，BEST4 細胞與杯狀細胞距離非常近（擴圖3.e-f）。
而進一步的功能分析發現小腸 BEST4細胞可能在杯狀細胞的粘液和酸生物合成方面起著一定作用（擴圖4）。
腸上皮細胞的多樣性
在上皮腔室中，分泌細胞由杯狀細胞、簇狀細胞、Paneth細胞和微折疊細胞以及前體狀態組成。
研究發現，吸收細胞和杯狀細胞在所有生命階段都表現出區域分離（圖2.a-b，擴圖5，擴圖6.a-b）；在早期發育中，腸細胞還表達了編碼跨膜絲氨酸蛋白酶的ACE2和TMPRSS2（圖2.c，擴圖6.c）。
腸內分泌細胞(EECs)的亞聚類結果表明，在妊娠早期的胎兒腸道中富集了表達NEUROG3的前體細胞，以及多個成熟亞群（圖2.d，擴圖6.d）。由NPW編碼的神經肽w可刺激食物攝入并在EECs中廣泛表達，作者進一步發現表達NPW的腸嗜鉻細胞亞群，對PRAC1和RXFP4同樣具有特異性（擴圖6.d)。參與NEUROG3前體分化為腸嗜鉻細胞過程的基因表達情況如圖2.e以及擴圖 6.e-f所示。此外，研究發現在簇狀細胞中差異表達最顯著的基因是PLCG2，表達與造血細胞相關的磷脂酶。通過對上游受體表達的分析，發現FCGR2A由大約2.75% 的簇細胞特異性表達（圖2.f）。
PLCG2在簇狀細胞中的表達水平高于B系和骨髓細胞，這一結論在體內和體外模型中均得到了證實（擴圖7）。以及包括RAC2、ITPR2、PRKCA和TRPM5等下游信號介質的高表達（圖2.f-h），都表明了簇狀細胞對免疫細胞信號作出反應的能力。
腸道神經系統的發育
接下來，作者研究了孕后6.5周數據集中神經細胞從腸神經嵴細胞(ENCC)祖細胞分化的情況（圖3.a），分別分析了早期（6-11 PCW）和晚期（12-17 PCW）的發育情況，以捕獲ENCC分化的離散過程（擴圖8.b）。
在早期發育中，ENCC主要通過神經目細胞分化為神經元，產生兩個不同的分支：分支A和分支B（圖3.a，擴圖9.a-d）,在該階段，分支A進一步分化為抑制性運動神經元（iMN）和兩個具有內在初級傳入神經元（IPAN）或中間神經元特征的亞群，（擴圖8.d），而分支 B 進一步分化為未成熟的興奮性運動神經元 (eMN)亞群（圖3.a）。在后期發育中，分支A分化為表達NEUROD6的中間神經元，而分支B分化為IPANs (圖3.b)。通過可視化，作者還觀察到了SCGN (分支A1) 和GRP (分支A2和A3)以及BNC2 (分支B1和B2)在發育中和成人肌叢的相反表達(圖3.c，擴圖8.e)。
在6-11 PCW階段，分化的神經元含量豐富，而發育后期則富集了神經膠質細胞，在12-17 PCW存在三種類型的腸神經和一個正在分化的神經膠質細胞亞型（COL20A1）（圖3.b，擴圖9.a-d）。結腸膠質細胞表達HOX基因和FAP2B，這表明它們起源于骶骨或軀干(擴圖8.g)，此外，作者在肌系膜叢中觀察到了BMP8B表達細胞，在腸系膜和肌腸系膜叢中均發現了DHH表達細胞(圖3.d，擴圖8.f)。
為了識別與巨結腸病(HSCR)相關的神經細胞，研究分析了已知的HSCR相關基因的表達，發現大多數HSCR相關基因在多個分化群體中都有不同程度的表達(圖3.e)，并在神經元分支A和B之間存在差異。此外，與HSCR相關的關鍵配體，如GDNF, NRTN 和EDN3主要由間皮細胞、平滑肌細胞等表達(擴圖8.h)。
次級淋巴器官的形成
腸道相關的淋巴組織和腸系膜淋巴結（mLN）是腸道免疫監測的關鍵，作者通過對胎兒和成人T細胞以及先天淋巴細胞的亞聚類，發現了三個符合淋巴組織誘導樣(LTi)細胞特征的亞群（圖4.a-b），它們高表達RORC, KIT, TNF等基因，缺失αβ TCR（擴圖10.b-d）。
先天淋巴細胞祖細胞(ILCPs)轉錄水平與胎兒的肝臟ILCPs相當，在胎兒mLN和胚胎腸道中均有發現，而NCR+和NCR?3型先天淋巴細胞(ILC3s))在6-17 PCW的腸道區域大量存在，這表明LTi-like ILC3亞群在腸道相關淋巴組織的發育過程中有所擴增，在mLN的發育過程中并沒有（擴圖10.e-f，擴圖11）。單分子熒光原位雜交(smFISH)染色識別出了所有三種LTi-like亞型（擴圖10.g），并發現在近端腸道黏膜中，表達CXCR5和RORC的LTi細胞位于表達CXCL13的LTo細胞附近（圖4.c）。這些結果表明ILCPs腸道發育中的第一類LTi樣細胞，代表了ILC3s的祖細胞狀態。
研究分別觀察了動脈、靜脈、毛細血管和淋巴管內皮細胞(LECs)（擴圖12.a-b）， LECs分成了六個簇，標記為LEC1-LEC6（擴圖12.c）。 LEC2 細胞表達淋巴結相關的TNFRSF9、THY1、CXCL5 和 CCL20等分子，以及 NF-κB通路的靶標和粘附分子，表明它們參與了淋巴細胞的運輸（擴圖12.d-e)。研究進一步證實，高內皮微靜脈結構的存在是淋巴細胞進入以及PROX1+血管靠近CXCL13+ mLTo 和RORC+ LTi細胞所必需的（擴圖12.f-g）。
在基質中，研究識別了肌成纖維細胞、平滑肌細胞、周細胞等細胞群體的亞型（圖 4.d)。作者進一步識別了小鼠淋巴結中典型的成纖維細胞群，包括T網狀細胞和濾泡樹突狀細胞；在產前腸道和mLN 中，觀察到一個以表達CCL19、CCL21 和CXCL13以及NF-κB通路分子為特征的基質群（擴圖13.a-f）。
然后，作者分析了控制早期白細胞招募的LEC2, mLTo和LTi-like細胞間的相互作用（擴圖13.g-h），以及胎兒和成人樣本之間 B 細胞活化狀態的差異（擴圖14)。
通過對初始免疫細胞亞群募集的可視化，該研究捕獲了可能與發育中的次級淋巴器官相對應的表達mLTo標記基因（CCL19、CCL21 和 CXCL13）（擴圖15.a-c）的組織區域。接下來，作者將淋巴器官的形成與在克羅恩病患者中觀察到的異位淋巴結構的形成進行了比較，發現克羅恩病患者組織中的ILC3s與胎兒 NCR+ ILC3s的匹配率超過60%。最后，作者通過對細胞類型的全基因組關聯分析，計算了與克羅恩病和潰瘍性結腸炎相關基因的富集得分，發現成人的ILC3s以及胎兒的ILCPs 和 NCR+ ILC3s細胞富集了與克羅恩病相關的基因（圖4.f，擴圖15.f）。
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