掃碼聯系客服
小編最近在NATURE COMMUNICATIONS（最近一年的影響因子為：14.919。比上一年增加了2.798)）這篇雜志上看到一篇單細胞測序的文章，《Single-cell analysis of diverse immune phenotypes in malignant pleural effusion》。最近的單細胞測序的狂熱自不必多說，但是除了單細胞測序這個熱點外，小編的第一反應是，這個樣本極容易獲得。值得我們學習。
背景知識：
不同免疫細胞之間復雜的相互作用在惡性胸腔積液的發生發展中起著重要作用。在這里，作者對非小細胞肺癌誘發的MPE患者的62,382個細胞進行單細胞RNA測序，以描述MPE中浸潤的免疫細胞的組成、譜系和功能狀態。與血液中相應的免疫細胞相比，MPE中的免疫細胞表現出大量富含調節性T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的轉錄特征。
malignant pleural effusion (MPE)：惡性胸腔積液
結果解讀：
為了研究mpE環境的免疫學特征，作者采用基于液滴的ScRNA-seq技術研究了MPE和血液中免疫細胞的轉錄譜(Fig.1a)。在對讀取深度和線粒體讀取計數進行基因表達歸一化的定性篩選后，仍有62,382個細胞可檢測到200-6,000個基因，以供后續分析。其中，33,089個細胞和29,293個細胞分別來自MPE和血液(Fig.1b)。通過分級聚類將19個表達組分組，從而確定了T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞和髓樣細胞的主要細胞室的特征，其中最豐富的MPE免疫細胞是T細胞(Fig.1c–e)。對于MPE和血液中各細胞類型的差異表達基因，作者采用基因集富集分析，確定與MPE相關的途徑。作者發現，MPE的糖酵解途徑以及細胞增殖和免疫反應信號明顯較高(Fig.1f)。在免疫細胞類型中，T細胞在MPE中顯著富集，而NK細胞在血液中顯著富集(Fig.1g)。
根據細胞譜系和功能狀態，T細胞亞群被鑒定為CD4+T細胞(初始CD4+T細胞、Th1/17細胞、T濾泡輔助細胞[Tfh]細胞和Treg細胞)；CD8+T細胞(初始T細胞、細胞毒性T細胞和耗盡T細胞)；增殖的T細胞，既有CD4+T細胞，也有CD8+T細胞(Fig.2a, b)。與先前在NSCLC中的發現一致，作者還發現MPE中細胞毒性T細胞的耗竭和Treg細胞的出現(Fig.2c)。
為了了解T細胞亞型之間的狀態轉換，作者使用Destiny繪制擴散圖，以數據為基礎構建T細胞亞型的潛在發育軌跡。從表達數據或標記基因推斷的發育軌跡表明，初始T細胞最終通過CD8+T細胞中的細胞毒性T細胞進入耗竭狀態(Fig.2d)。在CD4+T細胞中，初始T細胞位于與Tfh細胞和Treg細胞相對的一端，Th1/17細胞主要位于中心(Fig.2e)。 PDCD1是一個重要的免疫檢查點靶點，在Tfh中高表達，提示Tfh細胞也可能是PD1抑制劑在MPE中的效應細胞之一。79.7%的CD4+T細胞表達αβT細胞受體，其中CD8+T細胞的表達率為78.5%。在CD8+T細胞中，細胞毒性T細胞和耗盡的T細胞之間存在顯著的共享TCR (Fig.2f)。在每個樣本中都發現了這些共享的TCR，這表明T細胞增殖是MPE的常見現象，而不是某些癌癥患者的特征。作者將這些與細胞毒T細胞共同表達TCR的耗竭T細胞標記為耗竭c1簇，將未擴增的耗竭T細胞標記為c2。此外，作者還表明，與CD4+T細胞中的耗竭簇Tfh特征相結合，能夠區分高耗竭-C1特征的患者的預后(Fig.2g)。
根據典型B細胞標志物的表達和分布，作者鑒定了7個CD19+B細胞亞群和4個漿細胞亞群。血漿B細胞表達免疫球蛋白γ(IGHG)和XBP1(Fig.3a–c)。為了進一步研究B細胞的差異轉錄變化，作者比較了MPE中Breg細胞和幼稚B細胞的表達譜。作者分別比較了MPE和血液中幼稚B細胞和Breg的差異基因。作者得出的結論是，MPE中幼稚B細胞和Bregs基因表達的最高水平上調具有相似的富集模式。與血液中的相應細胞相比，MPE中的幼稚B細胞和Breg細胞表達更多的糖代謝信號(PKM、TPI1、ENO1和LDHA)、缺氧反應(NR4A2、CXCR4和HIF1A)和細胞增殖信號(H3F3B、MIF和ZFP36L2)。TNFRSF13B、ITGB1和LGALS1基因在Breg細胞中均顯著高表達(Fig.3d)，提示Breg細胞具有通過細胞間相互作用調節T細胞等其他重要免疫細胞的功能。為了探索Breg細胞和T細胞之間的相互作用，作者研究了特定的配體-受體是否參加Breg細胞和效應T細胞亞群之間的相互作用。作者的數據顯示，在MPE中，Breg細胞和CD8+T細胞之間的預測相互作用的數量顯著減少。Breg細胞的細胞間通訊以CD4+T細胞為主，包括Th1/17、Treg和Tfh(Fig.3e)。
作者檢測了髓系細胞的典型標記基因，并在MPE和血液中鑒定出簇。標記基因CD14、FCGR3A和CD68的高表達定義了7個單核/巨噬細胞簇。CD1C、CLEC10A和FCGR1A的高表達標志著兩個樹突狀細胞(DC)簇(Fig.4a–c)。作者檢查了巨噬細胞群中M1和M2狀態的標記基因的表達水平，發現MPE巨噬細胞高表達M2標記基因(Fig.4d)。這表明M1/M2分類與基于基因表達的單核/巨噬細胞亞類無明顯關系。與單核細胞相比，巨噬細胞的免疫應答、抗原提呈和糖酵解途徑活性顯著增強(Fig.4e)。DC有兩個亞群：MPE中富含DC-C7，并具有較高水平的免疫激活基因MIF、ALOX5、CKLF和CD1s (Fig.4f)。作者分析了MPE中巨噬細胞和單核細胞的軌跡，發現這些細胞有各自的軌跡狀態，表明腫瘤浸潤性巨噬細胞不同于單核細胞(Fig.4g)。
與血液相比，MPE中Tfh和巨噬細胞中代謝途徑的表達增加最多(Fig.5a)。幾乎所有的MPE細胞類型都上調了糖酵解相關代謝基因的表達；這些免疫細胞亞型的這種普遍的代謝特征與胸腔積液中的缺氧環境是一致的(Fig.5b)。在利用MPE中高表達基因繪制的糖酵解代謝路徑圖中，作者發現了一些限速基因，如ashk、pfk和pk，從而進一步證實了MPE中Tfh細胞的糖酵解代謝被激活(Fig.5c)。此外，戊糖磷酸途徑明顯下調，而OXPHOS和脂肪酸氧化略有上調，這與MPE巨噬細胞M2極化表型一致(Fig.5b)。 綜上所述，免疫細胞的這些代謝表型可能有助于建立它們與其他細胞相互作用和調節腫瘤微環境的功能。
此前，全基因組關聯研究(GWAS)已經在中國人群中確定了54個與非小細胞肺癌易感性相關的基因。作者在MPE中通過已經確定的簇進一步分析了這些基因，發現了預期的和令人驚訝的簇特定的表達模式(Fig.6)。BPTF在NK細胞和T細胞中高表達，抑制NK細胞活性，降低T細胞介導的抗腫瘤免疫。作者的結果還表明，腫瘤患者免疫細胞中易感基因的表達發生了變化，提示這些單核苷酸多態性和易感基因可能通過調節免疫細胞的功能而影響腫瘤的發生發展。
接下來，作者評估了特定免疫細胞類型對MPE形成的作用。在胸腔中，淋巴細胞通過重要的信號分子，如趨化因子、細胞因子和生長因子，控制血管活性事件的發生和MPE的發展。與低表達的患者相比，高表達趨化因子信號的患者的總體存活率明顯較低(Fig.7)。盡管對這些重要信號通路在MPE形成過程中的分子機制進行了研究，但它們與MPE診斷和治療的關系仍存在爭議。作者的研究結果支持趨化因子信號的細胞特異性表達與預后之間的關系。
全文小結：
在本研究中，作者在單細胞水平上對人MPE中的免疫細胞進行了詳細的分子描述，繪制了MPE和血液中免疫細胞的頻率和分子狀態的差異。具體地說，作者注意到MPE中Treg細胞、B細胞和巨噬細胞數量的增加，并顯示了對MPE重要的轉錄細胞狀態，主要包括Tfh細胞和Breg細胞。此外，作者在MPE環境中發現了Breg細胞與CD4+T細胞的特異性細胞間通訊，并且發現糖酵解途徑在MPE免疫細胞中普遍上調?？傊?，這項研究提供了來自復雜MPE微環境的免疫細胞的全局圖像，并描繪了免疫細胞不同于血液免疫細胞的轉錄特征活動。作者的數據可以作為后續深入研究的資源，以完成更深層次的生物學探索，并為晚期非小細胞肺癌的免疫治療提供治療靶點和生物標志物。
