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如何用生信分析解讀單個(gè)分子？
今天給介紹一篇發(fā)表在期刊: Oncoimmunology的文章，該期刊在最近一年的影響因子為 8.11，比上一年增加了2.241分。該篇文章最大的特色是講重點(diǎn)放在一個(gè)具體的分子上，值得我們學(xué)習(xí)。
轉(zhuǎn)移和免疫抑制是口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)預(yù)后不良的原因之一。YKT6是可溶性NSF附著蛋白受體(SNARE)家族的成員，其在口腔鱗癌中的作用尚不清楚。
WGCNA將紅色模塊確定為關(guān)鍵模塊，并對(duì)紅色模塊中的基因進(jìn)行了功能鑒定
模塊性狀相關(guān)熱圖顯示，口腔鱗癌中紅色模塊與PN分期和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)高度相關(guān)(Figure 1a)。這意味著紅色模塊中的基因可能是OSCC惡性腫瘤和預(yù)后的原因。因此，紅色模塊被確定為關(guān)鍵模塊。生物過程分析表明，紅色模塊中的基因在細(xì)胞外基質(zhì)的組織、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體信號(hào)通路的調(diào)控以及細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中都得到了豐富的表達(dá)。KEGG通路分析表明，這些基因與細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用和局部黏附有關(guān)(Figure 1b-c)。這些結(jié)果表明，這些基因可能介導(dǎo)了口腔鱗癌中的TME。
YKT6基因被選為影響口腔鱗癌患者預(yù)后的HUB基因
大多數(shù)DEGs在口腔鱗癌患者的癌癥標(biāo)志物中上調(diào)。來自GSE13601的基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組織相比，口腔鱗癌樣本中有946個(gè)DEG上調(diào)。在這項(xiàng)研究中，紅色模塊中連接性最高的100個(gè)基因與946個(gè)deg相交，產(chǎn)生29個(gè)候選基因(Figure 2a)。為驗(yàn)證29個(gè)候選基因?qū)︻A(yù)后的影響，將GSE42743隊(duì)列中的患者按29個(gè)基因表達(dá)高低分組，采用“Survminer”軟件包獲得的截?cái)嘀担M(jìn)行K-M生存分析和log-ranch檢驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)24個(gè)基因?qū)颊叩腛S有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著影響。在GSE41613和TCGA隊(duì)列中執(zhí)行上述篩選步驟后，作者使用來自訓(xùn)練集的相同截止值，最終得到可能影響OS和PFS結(jié)果的6個(gè)基因(YKT6、PLAU、BASP1、ANXA5、LGALS1和TGFBI） (Figure 2b）。在TCGA數(shù)據(jù)集中，SWSFS算法識(shí)別出一個(gè)組合了兩個(gè)基因的模型(YKT6, PLAU; Figure 2c) 。有一個(gè)基因(YKT6)在大多數(shù)癌癥中很少被報(bào)道，根據(jù)預(yù)后重要性排在榜首(Figure 2d)。在單因素Cox回歸分析中，YKT6的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，在使用GSE41613、GSE42743和TCGA數(shù)據(jù)的多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，YKT6的表達(dá)被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物( Figure 2e)YKT6已被證實(shí)在分泌途徑的多個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)步驟中發(fā)揮重要作用，其功能障礙可能與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。值得注意的是，YKT6在癌癥中的表達(dá)和功能，包括參與免疫相關(guān)的過程，在很大程度上仍不清楚。因此，YKT6被選為進(jìn)一步研究的候選基因。根據(jù)當(dāng)前研究中開發(fā)的諾模圖計(jì)算分?jǐn)?shù)來預(yù)測(cè)單個(gè)患者的1、3、5和7年的OS(Figure 2g)。校正曲線圖表明，諾模圖在根據(jù)理想模型預(yù)測(cè)患者OS方面表現(xiàn)良好(Figure 2h)。不出所料， nomogram模型預(yù)測(cè)OS的一致性指數(shù)在TCGA、GSE41613和GSE42743隊(duì)列中分別為0.612、0.705和0.631。此外，AUC值顯示，在所分析的因素中，YKT6的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，對(duì)OS的預(yù)測(cè)效果最好(Figure 2i-k)。
YKT6在侵襲性HNSCC/OSCC中的表達(dá)升高
首先，探討YKT6在HNSCC惡性中的作用。在MEXPRESS中，根據(jù)不同的臨床因素(包括解剖腫瘤的分類、治療后的疾病復(fù)發(fā)、EGFR狀態(tài)、HPV狀態(tài)、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、新腫瘤的出現(xiàn)、是否有神經(jīng)浸潤(rùn)和吸煙史)，YKT6呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式(Figure 3a)。卡方檢驗(yàn)和Fisher‘s精確檢驗(yàn)結(jié)果顯示，YKT6的表達(dá)與亞型有關(guān)(Figure 3b）UALCAN檢測(cè)結(jié)果表明，高病理分級(jí)、HPV陰性和TP53突變狀態(tài)的患者YKT6mRNA表達(dá)增加Figure 3c-e)。YKT6在間葉型、非免疫型、免疫型3型和創(chuàng)面愈合亞型中的表達(dá)明顯高于非典型型、主動(dòng)免疫型、免疫型4型和干擾素-γ顯性亞型，這反映了YKT6可能參與了轉(zhuǎn)移和侵襲，并在免疫冷表型中富集（Figure 3f-i)。此外，基于包含167個(gè)腫瘤樣品和45個(gè)正常樣品的大規(guī)模OSCC數(shù)據(jù)集，YKT6在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織（Figure 3j）在來自GSE78060的轉(zhuǎn)移性LN組中也得到了類似的結(jié)果 （Figure 3k)。在GSE30784和GSE41613數(shù)據(jù)集中，通過估計(jì)分析，作者發(fā)現(xiàn)YKT6與腫瘤純度呈正相關(guān)。與免疫評(píng)分呈負(fù)相關(guān) （Figure 3l-m)。綜上所述，這些結(jié)果表明YKT6過表達(dá)與HNSCC/OSCC的進(jìn)展、復(fù)發(fā)、免疫功能障礙和不良預(yù)后有關(guān)。此外，對(duì)YKT6進(jìn)行了基因組變異分析，發(fā)現(xiàn)YKT6存在深度缺失、淺層缺失、二倍體、拷貝數(shù)增加和擴(kuò)增。值得注意的是，在TCGA-HNSCC組織中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)YKT6的拷貝數(shù)增加和擴(kuò)增（Figure 3n)。YKT6基因拷貝數(shù)與mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（Figure 3o）。YKT6的CNV在染色體上的位置如 Figure 3p所示。作者還發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中YKT6的DNA甲基化水平降低 （Figure 3q)，并且YKT6mRNA的表達(dá)與cg44201263和cg44209692探針的甲基化水平呈弱負(fù)相關(guān)（Figure 3r)。WB和IHC染色蛋白水平結(jié)果與YKT6 mRNA水平的變化一致。WB顯示YKT6在OSCC組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織 (Figure 4a)。免疫組化染色顯示，YKT6蛋白的表達(dá)隨PN分期的升高而增加，在配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)低于口腔鱗癌組織。此外，有轉(zhuǎn)移灶的LN組織中YKT6蛋白水平高于鄰近無轉(zhuǎn)移腫瘤的正常LN組織中的YKT6蛋白水平(Figure 4b-f)。腫瘤分級(jí)越高，預(yù)后越差，在兩種組織芯片中，YKT6蛋白的表達(dá)隨著口腔鱗癌的惡性進(jìn)展而增加(通過組織學(xué)分級(jí)的變化來表示) (Figure 4g-i)。
YKT6被發(fā)現(xiàn)參與口腔鱗癌中與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路
利用GSE30784和GSE41613數(shù)據(jù)進(jìn)行GSVA分析，探討YKT6與生物學(xué)功能之間的關(guān)系。YKT6高劑量組細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)、缺氧、腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蛋白質(zhì)分泌和輸出、腫瘤壞死因子-α信號(hào)通過NF-κB顯著增加。YKT6低表達(dá)組與T、B細(xì)胞受體信號(hào)通路顯著相關(guān) (Figure 4j-k)。這些發(fā)現(xiàn)與圖1b-c所示的上述結(jié)果是一致的。基于這些發(fā)現(xiàn)，作者得出結(jié)論，YKT6在口腔鱗癌的惡性進(jìn)展過程中起著重要作用。
YKT6在體外促進(jìn)OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲
傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，YKT6的敲低抑制了細(xì)胞遷移能力(Figure 5a-d)。Transwell分析，包括遷移和侵襲分析表明，當(dāng)YKT6耗盡時(shí)，細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力都降低了 (Figure 5e-j)。一些研究報(bào)道基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)促進(jìn)癌細(xì)胞在口腔鱗癌中的遷移和侵襲，包括MMP9。如 Figure 5k-m所示，隨著YKT6基因敲除，口腔鱗癌細(xì)胞MMP9蛋白表達(dá)降低。通過上述生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，YKT6的表達(dá)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路密切相關(guān)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1被認(rèn)為是口腔鱗癌遷移和侵襲的關(guān)鍵啟動(dòng)者。有趣的是，當(dāng)YKT6被下調(diào)時(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-1的分泌減少 (Figure 5n-p)。這些結(jié)果證實(shí)了YKT6可能在口腔鱗癌的體外遷移和侵襲過程中起重要作用。
YKT6高表達(dá)與低CD8+T細(xì)胞水平相關(guān)
在此基礎(chǔ)上，作者探討了YKT6與CD8+T細(xì)胞的關(guān)系。TIMER2檢測(cè)結(jié)果顯示，HNSCC中YKT6mRNA的高表達(dá)與CD8+T細(xì)胞水平呈顯著負(fù)相關(guān) (Figure 6a)。此外，YKT6 CNV的變化改變了CD8+T細(xì)胞的水平 (Figure 6b)。此外，作者還評(píng)估了YKT6mRNA表達(dá)/CNV與TCGA-HNSCC隊(duì)列中其他五種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系。YKT6的表達(dá)與B細(xì)胞水平的關(guān)系值得關(guān)注。接下來，作者使用幾種算法在口腔鱗癌中進(jìn)行后續(xù)研究，在GSE30784和GSE41613數(shù)據(jù)集中，YKT6的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)(Figure 6c-e)。YKT6的高表達(dá)與B細(xì)胞和漿細(xì)胞水平低有關(guān)。除轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果外，免疫組化染色證實(shí)，隨著YKT6蛋白表達(dá)的增加，CD8(代表腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞)的蛋白水平降低（Figure 6f-h）。由于趨化因子和趨化因子受體介導(dǎo)了TME中免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，包括CD8+T細(xì)胞向腫瘤的募集。作者發(fā)現(xiàn)YKT6與HNSCC和OSCC中CCL5、CCR5、CCR2、CXCR3和CXCL9的表達(dá)呈高度負(fù)相關(guān)(Figure 6i-k)。總之，這些結(jié)果表明YKT6可能是腫瘤免疫微環(huán)境改變，特別是與CD8+T細(xì)胞相關(guān)的改變的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。
YKT6表達(dá)可預(yù)測(cè)ICB的臨床療效
為了進(jìn)一步闡明YKT6在免疫治療(以ICBS為代表)中的作用，作者將分析擴(kuò)展到Y(jié)KT6與幾個(gè)眾所周知的免疫檢查點(diǎn)基因之間的關(guān)聯(lián)。在TCGA-HNSCC隊(duì)列中，YKT6的表達(dá)與PD-1、CTLA-4、IDO1、BTLA、LAG-3、TIM-3、TIGIT和Vista的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(Figure 6l)。在GSE30784和GSE41613中有很強(qiáng)的一致性(Figure 6m-n).接下來，作者分析了口腔鱗癌患者ICBS的臨床療效。據(jù)報(bào)道，當(dāng)CD8+T細(xì)胞被激活時(shí)，以及在抗PD-L1和抗CTLA-4免疫療法的應(yīng)答過程中，細(xì)胞毒性、抗原呈遞和擴(kuò)大的免疫水平顯著升高。作者發(fā)現(xiàn)，隨著YKT6表達(dá)的增加，GSE30784和GSE41613隊(duì)列中的CYT、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)比例、檢查點(diǎn)水平、人類白細(xì)胞抗原(HLA)豐度、擴(kuò)大免疫、抗原提呈細(xì)胞(APC)共刺激水平和T細(xì)胞共刺激水平均下降(Figure 7a)。潮汐評(píng)分與YKT6表達(dá)的增加顯著相關(guān)(Figure 7b)。免疫治療有效的患者口腔鱗癌組織中YKT6的表達(dá)低于免疫治療無效的患者口腔鱗癌組織中YKT6的表達(dá) (Figure 7c)。作者進(jìn)一步研究了YKT6表達(dá)和IPS之間的關(guān)系，IPS是確定免疫原性決定因素和描述腫瘤內(nèi)免疫狀況的一個(gè)更好的預(yù)測(cè)因子。在GSE30784和GSE41613中，YKT6的表達(dá)與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)評(píng)分、效應(yīng)細(xì)胞(EC)評(píng)分和IPS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。關(guān)于抑制細(xì)胞(SC)評(píng)分，得到了相反的結(jié)果(Figure 7d-e)。此外，作者通過亞類圖譜的方法研究了YKT6高表達(dá)和低表達(dá)的口腔鱗癌患者對(duì)特異性CTLA-4和PD-1免疫治療的反應(yīng)。有趣的是，YKT6低表達(dá)的患者對(duì)抗PD-1治療有良好的反應(yīng)，而YKT6高表達(dá)的患者對(duì)抗PD-1治療無反應(yīng)(Figure 7f-g)。以上分析提示，YKT6低表達(dá)患者可能比YKT6高表達(dá)患者對(duì)ICB治療更敏感。為了進(jìn)一步了解與患者預(yù)后相關(guān)的不同免疫因素，作者通過比較YKT6表達(dá)與TEDER和IPS評(píng)分的時(shí)間依賴性AUC值，確定YKT6表達(dá)預(yù)測(cè)OS的準(zhǔn)確性。這兩個(gè)隊(duì)列中的這些分析表明，YKT6在預(yù)測(cè)口腔鱗癌患者生存方面比TEDE和IPS評(píng)分更好(Figure 7h-i)。在GSE35640和GSE91061數(shù)據(jù)集中，作者調(diào)查了YKT6是否可以預(yù)測(cè)患者對(duì)ICB治療的反應(yīng)。正如預(yù)期的那樣，與YKT6表達(dá)較低的患者相比，YKT6表達(dá)較高的患者從免疫檢查點(diǎn)治療中獲益的可能性較小(Figure 7j-k)，并測(cè)定了AUC值(>0.600)對(duì)預(yù)測(cè)客觀反應(yīng)的敏感性和特異性(Figure 7l-m)。
YKT6在人類癌癥中的研究概況
考慮到Y(jié)KT6相關(guān)腫瘤研究的缺乏，特別是在實(shí)體瘤中，作者評(píng)估了YKT6在31例非HNSCC實(shí)體瘤中的表達(dá)。總體而言，YKT6在許多癌癥類型中過度表達(dá)。由于樣本量的限制，YKT6在黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等一些癌癥中沒有發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)(Figure 8a)。為了研究YKT6的表達(dá)與瘤內(nèi)免疫狀態(tài)的關(guān)系，作者分析了YKT6在6種免疫亞型中的表達(dá)。此外，在包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤中，YKT6表達(dá)上調(diào)與低免疫評(píng)分、激活的CD8+T細(xì)胞水平、激活的B細(xì)胞水平、效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞水平、嗜酸性粒細(xì)胞水平、細(xì)胞色素T細(xì)胞、免疫信號(hào)評(píng)分、高腫瘤純度、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用水平、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路水平和EMT_2水平有關(guān)(Figure 8b-g）。同時(shí)，在包含9,163個(gè)腫瘤樣本的獨(dú)立TCGA腫瘤隊(duì)列中，通過單因素Cox回歸分析，也驗(yàn)證了YKT6表達(dá)對(duì)OS和PFS的預(yù)后價(jià)值。YKT6的表達(dá)在幾個(gè)獨(dú)立的TCGA隊(duì)列中被支持作為一個(gè)預(yù)后生物標(biāo)志物，其中一些包含高免疫原性、TMB和免疫浸潤(rùn)的腫瘤，如乳腺癌、肺癌、腎癌、肝癌、尿路上皮癌和宮頸癌 Figure 8h)。最后，檢測(cè)YKT6的表達(dá)在藥物敏感性中的作用。多種化療藥物的IC50值與YKT6在多水平上顯著相關(guān)。YKT6的表達(dá)可作為5-氟尿嘧啶和索拉非尼耐藥的生物標(biāo)志物。
本文小結(jié)：
作者的研究還揭示了YKT6與口腔鱗癌細(xì)胞體外遷移/侵襲和免疫微環(huán)境重塑密切相關(guān)，反映了YKT6在腫瘤發(fā)生和預(yù)后中的作用。然而，體內(nèi)驗(yàn)證需要在我們未來的研究中解決。此外，應(yīng)該在體外和體內(nèi)系統(tǒng)闡明解釋這些觀察結(jié)果的更深入的分子機(jī)制，以優(yōu)化治療，其中可能包括將YKT6特異性抑制劑與口腔鱗癌患者的ICBS相結(jié)合的策略。
