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在單細胞轉錄組分析中，差異表達分析是必不可少的一步，也有諸多對應的統(tǒng)計方法，然而這些方法的準確性，取決于其能否具有在類似樣本中被重復，如果忽略了不同樣本間無法避免的差異，就會將樣本間差異看成是導致的不同細胞間的表達量差異，從而造成虛假發(fā)現。自然通訊的論文“直面單細胞差異分析中的假陽性結果”，指出當前最常用的方法，在測試的小鼠受傷脊柱細胞中，會會在沒有生物學差異時，發(fā)現上百個虛假的表達量差異。
1用于檢驗的金標準數據集
為了判別是否為假陽性的檢測，該研究采用了在相同的細胞類型，相同的實驗環(huán)境以及相同實驗室測序的單細胞和bulk RNA測序，將bulk RNA中找到的細胞間差異當成是真實的，該研究通過文獻調研，找到了八個這樣的差異數據集。
用于檢測表達量差異的統(tǒng)計方法，選取了最常用的14個，這些方法加起來，使用量占據了當前相關研究中的近90%，下圖是使用方法的在單細胞研究中出現的次數。
其中的方法，可以分為三類，將bulk RNA中出現的表達量差異當成真集，可以看到pseudobulk的方法，其和金標準的一致性最高。這類表現最好方法的共同之處，是其會將相同條件下的單細胞數據先進行整合，形成偽bulk RNA測序結果，之后再進行比較，相比直接使用單細胞進行比較的方法，pseudobulk的方法，其假陽性的概率更低。
為考察不同方法檢出的表達量差異在功能上的影響，通過基因本體（Gene Ontogeny）上進行注釋，之后比較其和金標準的一致性，其中仍然是pseudo-bulk的方法表現最佳，這說明檢出的假陽性差異基因，有著對應的生物學功能，會影響下游分析。
單細胞數據和對應的bulk數據，在低表達量的基因上，更容易出現假陽性的表達量差異檢測，如下圖所示，在低表達量的基因上，由于個體差異，導致不同類型間細胞中檢出的表達量差異，不論哪種方法，都更和金標準一致率更低。
將基因按表達量分為高中低三檔，使用多種判定方法，都是表達量高的基因其一致性更高。
基因的平均表達量在該樣本中的相對位置越高，其存在差異表達的判定越準，和金標準的一致率越高
之后，通過實驗論證單細胞分析中，存在著廣泛的假陽性。通過spike in技術，可以在細胞中加入等量的一百種mRNA，這些mRNA對應的基因，并不應該被識別為差異表達基因。但在單細胞轉錄組分析中，最常用的判定差異表達的方法：秩和檢驗中，該方法會將平均表達量越高（橫軸）的基因，以越高的置信度（縱軸，p值得對數結果）被判定為存在差異表達，而psuedo bulk的方法（右圖）則不會這樣，這進一步，通過實驗說明了常用的判定方法會帶來假陽性。
人工加入的等量表達基因，被錯誤的當成存在差異表達的基因，其平均表達量越低，其存在表達量差異的p值，在秩和檢驗下就越大。
基因的平均表達量在該樣本中的相對位置越高，其存在差異表達的判定越準，和金標準的一致率越高。
為避免假陽性，一種方法是采取重復樣本，之后合并分析。但如果生物學重復之間存在顯著差異，那么這種情況下，采用重復樣本后，仍然有可能會識別出假陽性的差異表達。為說明這一現象，該研究通過模擬數據，對比組間異質性高和低的重復樣本，在使用了數據合并后，能否減少檢出的差異基因中假陽性的比例。模擬數據包含了10份來自同一類細胞的重復，隨機分為對照組和病例組，之后根據不同的重復之間的一致性，發(fā)現組間異質性低的，隨機分成的兩類，在降維后沒有差異，但對于組間差異大的，降維后隨機分成的兩組看上去卻是有差異的。
不論重復樣本的組間表達量差異，由于其具有同樣的生物學屬性，不應該有表達量差異，但實際采用秩和檢驗，以及采用pseudo bulk方法，在組件表達量差異較大時，都會找到對應的表達量差異基因，這說明此時使用重復樣本，如果樣本間的差異較大，也無法避免假陽性的差異基因檢出，但通過構建偽bulk的方式，可以減少假陽性的發(fā)現。
采用了對照重復樣本（模擬生成后）檢出的差異基因（皆為假陽性）數量，當組間差異較大時，使用偽bulk的方法，雖然比秩和檢驗檢出的假陽性數量少，但并不能如真實的重復對照，減少假陽性的差異基因檢出。
在14個包含至少6個對照樣本的單細胞數據中，同樣可以看出，使用pseudo bulk的方法，得到的假陽性差異表達明顯小于單個細胞去檢測的方法。
在小鼠脊柱的空間轉錄組中，通常也使用單細胞轉錄組采取的方法來檢出差異基因，此時將對照組隨機分為兩類，生成的不應有差異的樣本，對比pseudo bulk的方法edgeR-LRT以及秩和檢驗，同樣發(fā)現pseudo bulk的方法，在各個組織間，其產生的假陽性檢出明顯更少。
之后，在真實的，經過驗證的數據集上，對比單細胞測序，由pseudo bulk法檢出的差異表達基因Igbp6，以及秩和檢驗檢出的prex2，前者可以從表達量的箱線圖，看出其中確實和RNAscope檢出的結果類似，而對于秩和檢驗檢出的prex2，其均值相同，但由于細胞間差異量大，也被非參數檢測，判定為存在差異，而這就是一個假陽性的發(fā)現。
之后再經過實驗驗證，發(fā)現同一批數據，使用pseudo bulk的方法，檢出的差異基因，其中5/6是可以被驗證的，而秩和檢驗的結果，只有不到25%的差異基因可以被實驗驗證。
總結，該文指出，單細胞轉錄組由于檢測靈敏性的問題，有可能產生虛假的差異表達基因，假陽性的多少，取決于使用的統(tǒng)計方法，以及重復對照樣本的組間異質性。相較于常用的分參數檢驗，psuedo -bulk的統(tǒng)計方法，假陽性率更低，組間差異越小，假陽性率越低。該研究還指出虛假發(fā)現是單細胞轉錄組及空間組中一個普遍存在的現象。差異表達檢出的假陽性如此之多，不僅會加重科研的可重復性危機，還會造成很多科研經費被浪費在無意義的驗證實驗上。這突顯了學術界必須采用適當的統(tǒng)計方法，防止虛假發(fā)現的擴散。
