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大家好呀，今天小編給大家帶來的一篇今年二月發表在Frontiers in Endocrinology(IF=6.055)上的一篇文章。題目：“Integrating single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq to construct prognostic signatures to explore the role of glutamine metabolism in breast cance”作者基于谷氨酰胺代謝相關基因，整合單細胞及bulk RNA-seq數據，構建了一個預后signature。這是一篇很典型的模板分析范文，快來和小編一起學習一下吧！
一.研究背景
乳腺癌(breast cancer,BC)是女性發病率第一的癌癥。近幾十年來，乳腺癌的治療策略已由傳統的根治性乳腺切除術聯合放化療向新輔助化療、內分泌治療、靶向治療聯合手術等綜合多模式治療轉變，但由于患者異質性較高，部分患者仍然無法從常規治療中獲益，生存預后較差。谷氨酰胺和谷氨酸是非必需氨基酸，是合成氨基酸、脂類和核酸所需氮和碳的主要來源，但對腫瘤細胞的代謝過程很重要。侵襲性癌癥，如三陰性乳腺癌(TNBC)，其惡性表型特征之一是谷氨酰胺的代謝。利用谷氨酰胺代謝相關基因預測治療療效和臨床預后值得進一步研究。因此，本篇文章基于谷氨酰胺代謝相關基因(GRGs)，通過分析乳腺癌單細胞RNA-seq及bulk RNA-seq數據構建了一個谷氨酰胺代謝的預后signature，以期為BC的診斷和治療提供新的視角。
二.主要結果
1.BC單細胞數據分析
圖一展示了本研究的流程圖。通過質量控制，降維聚類分群等單細胞數據處理操作后，10個樣本的細胞共分為18個簇(圖2A、B)。基于已知的細胞marker基因表達，將細胞注釋為8種細胞類型，如內皮細胞、肥大細胞、成纖維細胞和腫瘤細胞(圖2C、D)。接下來，作者通過R包AUCell計算了各細胞類型的GRGs活性打分，探討GRGs的表達特征(圖2E)。作者根據GRGs的AUC評分中位數將其分為高-谷氨酰胺AUC組和低-谷氨酰胺AUC組，結果表明，AUC值主要在巨噬細胞中較高(圖2F)。
2.加權共表達網絡分析與構建
在這一部分，作者通過WGCNA分析尋找與谷氨酰胺共變的基因集。如圖3A所示，選擇軟閾值為6進行后續的分析；將相似度低于0.25的模塊合并，最終生成12個非灰度模塊(圖3B、C)，作者發現，綠色和紫色模塊(每個模塊包含2,783個基因)與谷胱氨酸基因的關系最密切。為了進一步探索GRGs與BC患者預后的關系，作者將單細胞和Bulk-RNA分析中獲得的影響谷氨酰胺代謝活性的最相關基因取交集，最終219個基因用于后續分析(圖3D)。接下來作者在TCGA-BC的訓練集上使用單因素回歸分析確定預后基因；LASSO-Cox回歸和多因素回歸分析用于建立預后模型(圖3E)。最終的預后模型包含21個基因，其中8個是危險因素，13個是保護因素(圖3F)。
3.谷氨酰胺相關預后模型的驗證和nomogram的構建
為了證明谷氨酰胺相關預后模型的可信度，作者進行了生存分析。結果表明，在訓練、測試和所有隊列的患者中，高危組患者的總生存率較低危組更低(圖4A-C)；在外部驗證集的GEO隊列中也獲得了相同的結果(圖4D)。作者在訓練隊列和試驗隊列中進行ROC曲線分析，以進一步研究谷氨酰胺相關預后模型在評估BC患者預后中的準確性。結果表明，谷氨酰胺相關預后模型具有良好的預測效能(圖4E-H)。
接下來作者利用臨床信息和風險評分建立nomogram圖(圖4I)，校準曲線驗證了nomogram圖與作者的預測具有較好的一致性，與實際結果具有較好的一致性(圖4J)。作者還進行了決策曲線和一致性指數研究，表明該nomogram在預測患者預后方面是有效的(圖4K、L)。通過ROC曲線進一步評估nomogram的準確性，結果表明其準確性良好(圖5A-C)。
4.突變景觀分析
在這一部分，作者著重研究了高危組和低危組代表性基因的突變情況(圖5D)。TP53、KMT2C、HMCN1、USH2A、DMD等基因在高危組中突變率居前五位。低危組突變率最高的前5位基因分別為PIK3CA、CDH1、MAP3K1、PTEN和GATA3。腫瘤突變負荷(Tumor mutation load, TMB)在兩組間有顯著性差異，高危組突變負荷高于低危組(圖5E)。進一步分析顯示，隨著風險評分的增加，腫瘤突變負荷也相應增加，兩者呈正相關(圖5F)。對患者進行亞組分析后發現，高風險得分/高TMB組患者的生存預后較差(圖5G、H)。
5.生物學功能和通路分析
在這一部分，作者主要探討BC高危組患者預后不良的潛在機制。基因集變異分析(GSVA)結果顯示，高危組中富集的hallmark包括糖酵解、Myc Targets V1、G2M檢查點和E2F靶點;低危組富集特征包括炎癥反應、IL6 jak stat3信號和干擾素γ反應等(圖6A)。
高危樣本可能通過上調糖酵解途徑而導致BC患者預后變差；有研究表明高MYC靶點v1和v2評分與ER陽性BC中促癌和抗癌免疫細胞浸潤增加有關。這些通路在BC高危組中更為普遍，可能在控制腫瘤發展中起著至關重要的作用。為了探索高危組和低危組樣本的TME，作者使用ssGSEA來評估兩個危險組之間的免疫細胞組成，如圖6B、C顯示，在高危組患者的腫瘤微環境中，免疫細胞浸潤程度普遍低于低危組。
6.免疫景觀與免疫治療
為了進一步了解TCGA-BC隊列中22種腫瘤浸潤免疫細胞(TICs)的相對含量的分布和相關性，作者使用CIBERSORT方法測量了每個樣本中的免疫細胞浸潤水平。作者發現低危組的免疫細胞浸潤總體高于高危組。NK細胞和T細胞CD4+在高危組浸潤更多(圖7A)。通過使用R包ESTIMATE，低危組的基質評分、免疫評分和ESTIMATE評分較高，表明該組的TME總體免疫水平和免疫原性較高。作者還分析了腫瘤純度，結果顯示兩者呈正相關(圖7B、C)。
接下來作者還進行了免疫檢查點分析和免疫治療反應評估，氣泡圖顯示了模型基因和46個免疫檢查點基因之間的相關性(圖8A)，在高危組中僅觀察到1個免疫檢查點基因ICOSLG的表達(圖8B)。作者發現，低危亞型的免疫表型得分(IPS)和檢查點阻斷評分高于高危亞型，突顯出低危患者可能更適合接受免疫檢查點抑制劑(ICI)治療，并獲得更顯著的獲益(圖8C)。作者還進行了腫瘤免疫功能障礙和排除(tumor immune dysfunction and exclusion, TIDE)分析，結果表明高危組TIDE評分較低，風險評分與TIDE呈負相關(圖8D)。
7.SNX3在BC樣品中的表達
TCGA數據中SNX3的生存預后分析顯示，SNX3高表達的乳腺癌患者預后較差(圖9A)，且SNX3在BC組織中有較高的表達水平(圖9B)，圖9C顯示了NX3的GO富集分析柱狀圖。作者在其自己的臨床組織樣本中發現了相同的表達趨勢(圖9D)。通過細胞培養實驗，圖9E顯示轉染MDA-MB-231和MCF-7細胞中SNX3的表達明顯降低(圖9E)。
接下來作者對SNX3基因進行了實驗驗證。敲低SNX3后，MDA-MB-231和MCF-7細胞株的集落形成能力顯著降低(圖10A)。在5-乙基-2脫氧尿苷(EdU)測定中，敲除SNX3，MDA-MB-231和MCF-7細胞系的增殖能力顯著降低，提示SNX3可能促進增殖(圖10B)。圖10C,D中的Healing和Transwell實驗表明，SNX3敲低后，細胞遷移和侵襲比紊亂的siRNA慢，表明敲低SNX3可能會減弱MDA-MB-231和MCF-7細胞株的遷移和侵襲。
至此，這篇文章就介紹完啦。總結一下，作者首先在單細胞和bulk RNA-seq數據中分析了谷胱氨酸代謝相關基因的表達情況，其次通過WGCNA分析得到了與谷胱氨酸代謝最相關的基因模塊，并通過這些基因構建了一個預后打分模型。接下來就是大家常見的分組比較各種差異了，最后對SNX3這個預后基因進行實驗驗證，發現對其敲低降低了腫瘤細胞的集群和遷移侵襲能力。縱觀全文，沒有一個大家不會的生信方法，生信套路分析+簡單實驗驗證永遠是發文的利器！
