掃碼聯(lián)系客服
隨著m6A甲基化的發(fā)現(xiàn)和測序技術的發(fā)展，關于m6A的研究文章在各大高分雜志層出不窮，與此同時，m6A的研究也慢慢的進入精細化研究，這就出現(xiàn)了一個問題，下一步，m6A的研究應該如何開展。近日一篇由Hui Han等人發(fā)表在Molecular Therapy: Nucleic Acid（IF：8.886）上的文章：“ METTL3 mediated m6A mRNA modification promotes esophageal cancer initiation and progression via Notch signaling pathway ” 揭示了METTL3介導的m6A修飾在促進ESCC啟動和進展中的關鍵功能。
研究背景和待解決的問題
食管癌是一種致死性惡性腫瘤，死亡率高，食管鱗癌占食管癌的90%以上，異常的基因改變和/或表觀遺傳學異常常導致食管鱗癌（ESCC）的發(fā)病機制。此外，錯誤調控的DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA也會導致錯誤調控的基因表達和促進ESCC的發(fā)展。先前的研究表明，m6A甲基轉移酶METTL3可增強多種癌基因的表達，從而促進癌癥的進展。但METTL3介導的m6A修飾的生理功能及其在食管鱗癌（ESCC）中潛在分子機制仍不清楚。
因此本文要解決的問題是METTL3介導的m6A修飾是否參與了ESCC腫瘤產生與進展的過程，如果有，那么m6A在ESCC調節(jié)中的下游靶點和潛在分子機制是什么？
結果
一、食管鱗癌中METTL3升高，與ESCC預后不良相關
為了研究METTL3介導的m6A修飾在食管癌中的潛在功能，研究人員使用TCGA數(shù)據(jù)庫測定了METTL3在食管癌患者樣本中的表達。結果表明：
1、與正常組織相比，食管腫瘤組織中的METTL3 mRNA表達顯著上調；
2、METTL3的高表達與晚期腫瘤分級和癌癥分期以及食管癌的高淋巴結轉移活性相關。
3、METTL3表達較高的患者無病生存狀態(tài)明顯較差。
4、對食管癌患者隊列中的腫瘤組織進行了METTL3免疫組織化學（IHC）染色結果發(fā)現(xiàn)，ESCC腫瘤組織中METTL3的表達明顯高于腫瘤周圍組織。
結果表明，m6A甲基轉移酶METTL3在ESCC中顯著上調，并與ESCC預后不良相關。
二、靶向 METTL3 表達會損害 ESCC 進展
上述 METTL3過表達對ESCC預后不良影響的結果非常顯著，因此研究人員希望進一步研究METTL3調節(jié)ESCC的潛在分子機制。
研究人員使用shRNA1和shRNA21均顯著降低METTL3蛋白表達，而METTL3的敲除抑制ESCC細胞的增殖和部落形成。其次研究人員進行傷口愈合試驗和遷移試驗，進一步發(fā)現(xiàn)METTL3缺失顯著減少了ESCC細胞的遷移。此外，細胞侵襲試驗表明，METTL3的敲除降低了TE-9和TE-10細胞的侵襲能力。
以上體外結果揭示了METTL3的缺失導致體外和體內ESCC的生長和進展降低。
三、METTL3介導的m6A修飾調節(jié)Notch信號通路
既然確認 m6A在ESCC進展調節(jié)中的關鍵作用，因此下一步就是確定m6A在ESCC調節(jié)中的下游靶點和潛在分子機制。作者使用 meRIP-seq 實驗及進行了RNA-seq數(shù)據(jù)的基因本體分析，對 ESCC細胞中 RNA 的 m6A 修飾狀況進行了研究。結果表明METTL3在ESCC細胞中調節(jié)Notch通路的潛在功能，此外，基因集富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)ESCC細胞中METTL3的缺失導致Notch信號通路基因表達的顯著變化。
Notch信號通路是癌癥中重要的致癌通路，因此研究人員進一步研究了METTL3介導的m6A mRNA修飾在ESCC中Notch通路調控中的作用。表達分析顯示，與對照組相比，ESCC樣本中NOTCH1表達顯著上調。此外，METTL3和NOTCH1的表達顯著相關，接下來在敲除了METTL3的表達后，研究人員發(fā)現(xiàn)METTL3的缺失導致NOTCH1的m6A修飾水平、mRNA和蛋白質表達水平降低。
上述結果均揭示METTL3調節(jié)ESCC細胞中m6A修飾和NOTCH1受體的表達。
四、Notch通路的激活拯救了METTL3缺失的ESCC細胞中的ESCC進展
為了確定Notch信號通路是否是ESCC中METTL3的關鍵下游靶點，研究人員進一步通過強制激活METTL3缺失細胞中的NOTCH1進行拯救試驗。結果表明，NOTCH1信號通路的強制激活挽救了METTL3敲除ESCC細胞的生長和集落形成能力。此外，傷口愈合、遷移和侵襲分析進一步顯示，NOTCH1激活顯著促進METTL3缺失的ESCC細胞的遷移和侵襲。
機制上，研究人員發(fā)現(xiàn)NOTCH1信號通路是促進METTL3在ESCC進展中功能的關鍵m6A靶點，因此靶向Notch通路是治療ESCC的一種有前途的治療策略。
五、Mettl3的敲除抑制體內ESCC起始
為了確定Mettl3在ESCC啟動調節(jié)中的作用，研究人員首先通過三苯氧胺注射誘導Mettl3敲除，然后使Mettl3 cKO和對照小鼠接受16周4NQO治療以誘導ESCC形成。第21周，處死小鼠，分析Mettl3 cKO和對照小鼠的ESCC腫瘤發(fā)生。
結果表明：
1、與對照組小鼠相比，Mettl3基因敲除導致cKO小鼠食管中的病變更少且更小。
2、蘇木精-伊紅染色（H&E）顯示Mettl3 cKO小鼠比對照小鼠的發(fā)育不良和鱗狀細胞癌數(shù)量顯著減少。
3、IHC染色進一步發(fā)現(xiàn)，來自Mettl3 cKO小鼠的ESCC中Ki67、NOTCH1和HES1表達水平顯著降低。
這些結果表明Mettl3基因敲除降低了NOTCH1信號通路活性，并減少了ESCC在體內的增殖。
六、Mettl3對體內ESCC進程至關重要
研究人員利用Mettl3基因敲除和敲除小鼠模型建立了體內ESCC腫瘤模型，用Mettl3 cKO小鼠確定Mettl3在ESCC進展中的作用。步驟如下：
首先，處理角蛋白14 CreER；Mettl3fl/fl和對照組小鼠用4NQO誘導ESCC形成16周。
之后，向所有具有相同荷瘤條件的小鼠注射三苯氧胺，以在cKO小鼠中誘導Mettl3敲除。
最后在第21周，處死小鼠，以分析Mettl3在體內ESCC進展中的功能。
結果表明：
1、與對照組小鼠相比，荷瘤小鼠的Mettl3基因敲除導致進展緩慢，腫瘤癥狀減輕，cKO小鼠可見病變面積減少。
2、在已存在ESCC的小鼠中，Mettl3基因敲除可顯著減少發(fā)育不良和鱗狀細胞癌的數(shù)量。
3，Mettl3基因敲除還導致ESCC中Ki67表達和NOTCH1信號通路活性降低，表明Mettl3對ESCC在體內的NOTCH1激活和增殖活性至關重要。
七、METTL3過表達促進Mettl3轉基因小鼠體內外ESCC腫瘤發(fā)生
鑒于METTL3在人類ESCC樣本中的表達顯著上調，研究人員確定METTL3的過度表達是否可以促進ESCC的進展。數(shù)據(jù)顯示METTL3的過度表達促進了ESCC細胞中NOTCH1的表達，功能上，METTL3過表達促進ESCC細胞的增殖、遷移、侵襲和集落形成能力，進一步支持METTL3-m6A-NOTCH1軸在ESCC進展調節(jié)中的基本功能。
研究人員進一步建立了Mettl3條件敲除（cKI）小鼠模型，以研究Mettl3在ESCC體內腫瘤發(fā)生中的作用。實驗步驟如下：
1、將角蛋白14-cre小鼠與Mettl3ki/wt小鼠雜交，以產生Mettl3小鼠模型。
2、用4-硝基喹啉N-氧化物（4NQO）治療Mettl3 cKI和對照小鼠16周，以誘導ESCC腫瘤發(fā)生。
3、第20周，處死小鼠，研究Mettl3過度表達在ESCC體內腫瘤發(fā)生中的作用。
結果表明：
1、與對照組小鼠相比，Mettl3 cKI小鼠可見病變區(qū)域顯示的腫瘤負荷顯著增加。
2、蘇木精-伊紅（H&E）染色顯示，與對照組小鼠相比，cKI小鼠異型增生和鱗狀細胞癌的數(shù)量顯著增加，這表明強制表達Mettl3導致ESCC的腫瘤發(fā)生率增加。
3、IHC染色發(fā)現(xiàn)cKI小鼠中Mettl3和Ki67水平顯著上調，表明cKI小鼠的腫瘤更具侵襲性。
4、METTL3 cKI小鼠中NOTCH1 HES1和SOX2的表達顯著上調，證實METTL3在體內激活ESCC中的NOTCH1信號通路。
討論
先總結一下這篇文章的思路：
1.使用TCGA數(shù)據(jù)庫測定了METTL3介導的m6A修飾在食管癌患者樣本中的表達。
2. 使用兩種不同的RNA（shRNA1和shRNA2）研究METTL3調節(jié)ESCC的潛在分子機制， 體外結果揭示了METTL3在ESCC進展調節(jié)中的關鍵作用。
3. MeRIP-Seq 鑒定m6A在ESCC調節(jié)中的下游靶點和潛在分子機制，聚焦到 Notch上；
4. METTL3介導的m6A修飾在ESCC中調節(jié)Notch信號通路的潛在作用進行驗證；
5. 對 Mettl3在體內調節(jié)ESCC啟動和進展的功能進行研究
總的來說，研究人員采用了強有力的體外和體內證據(jù)支持METTL3介導的m6A修飾在促進ESCC啟動和進展中的關鍵功能。本文整套實驗下來從大到小逐級深入，不失為一個研究m6A修飾的教科書級別思路，建議收藏借鑒。
