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今天給大家分享一篇2023年1月3日發表在Nature Communications （IF:17.694）上，局部晚期胃癌新輔助治療/轉化化療相關的文章。
Neoadjuvant therapy with immune checkpoint blockade, antiangiogenesis, and chemotherapy for locally advanced gastric cancer
局部晚期胃癌的新輔助治療/轉化化療
一．研究背景以及研究方法
免疫檢查點抑制劑(ICI)和抗血管生成藥物在晚期cT4a/bN+胃癌中具有一定療效，但其在新輔助/轉化治療中的療效尚不清楚。在這項單臂性II期臨床試驗(NCT03878472)中，作者評估了ICI (camrelizumab)、抗血管生成藥(apatinib)和化療藥(奧沙利鉑)聯合應用于cT4a/bN+胃癌新輔助/轉化治療的療效。
主要終點是病理反應。次要終點包括安全性、客觀緩解、無進展生存期和總生存期。結果表明，完全和主要病理反應率分別為15.8%和26.3%。病理反應與微衛星不穩定狀態、PD-L1表達和腫瘤突變負荷顯著相關。此外，多組學整合分析揭示了幾種病理反應的假定的生物標志物，包括RREB1和SSPO突變、免疫相關特征和外周T細胞擴增評分。多組學分析還表明了新輔助免疫治療期間顯性腫瘤亞克隆、免疫微環境和T細胞受體庫(TCR)的動態變化。這些數據支持在大型隨機試驗中進一步驗證基于ICI和抗血管生成的新輔助/轉化療法的療效，并為其提供潛在的生物標志物。
二．研究結果
1、隊列的樣本臨床信息以及術后評估
2019年5月至2021年8月，納入25例患者，年齡在48至70歲，其中11例cT4aN+和14例cT4bN+。所有患者均完成了新輔助治療和手術評估(圖1b)。其中4例不能切除，2例拒絕手術，剩余19例患者接受手術，病理反應可評估。中位隨訪時間為24.7個月(圖1 b)。
在11例cT4aN+胃癌患者中，9例(81.8%)達到了降期。3例(27.3%)患者出現部分緩解，8例(72.7%)患者病情穩定(圖1c)。其中9例行R0切除術。由于手術中發現腹膜轉移，兩例切除為姑息性治療(圖1b)。中位隨訪26.7個月，9例根治性切除患者中有7例(77.8%)存活，5例(55.6%)無復發(圖1d)。
在14例cT4bN+患者中，10例(71.4%)達到了降期。4例(28.6%)患者有部分緩解，10例(71.4%)患者病情穩定(圖1c)。其中，8例(72.7%)行根治性切除，1例在手術中發現腹膜轉移，3例經評估不能切除(圖1b)。在隨訪中，8例根治性切除患者中有4例(50.0%)無復發，其中5例(62.5%)存活(圖1d)。
圖1：研究隊列設計和臨床療效
2. 病理結果
對19例患者評估了病理反應。高微衛星不穩定性(MSI-H)、PD-L1陽性(CPS≥1)、ERBB2擴增和Lauren彌散型的基線頻率分別為15.8%、16.7%、21.1%和52.6% (圖2 a)。其中3例(15.8%)達到完全病理緩解(CPR)，5例(26.3%)達到主要病理緩解(MPR)，8例(42.1%)達到部分病理緩解(PPR) (圖2 a)。MPR樣本的形態變化包括細胞外粘蛋白池、纖維化和淋巴細胞浸潤(圖2d)。病理緩解與放射緩解患者具有大部分重疊，80%MPR患者放射部分緩解(圖2b)。圖2e的CT掃描圖像顯示了兩例MPR患者(P1和P18)在新輔助治療后的部分緩解。
在5例MPR患者中，2例MSI-H和PD-L1陽性，1例MSI-H和PD-L1陰性，1例微衛星穩定(MSS)和PD-L1陽性并伴有ERBB2擴增，1例基線時MSS和PD-L1陰性(圖2a)。相比之下，非MPR患者均為MSS和基線PD-L1陰性。在新輔助治療后，2例PD-L1陰性MPR和4例非MPR腫瘤轉變為PD-L1陽性(圖2c)。
作者通過多重免疫熒光進一步研究了1例MSS和PD-L1陰性的MPR病例(P18)和2例非MPR病例(P10和P20)(圖2f)。在P18預處理樣本中，腫瘤細胞密集分布，很少有PD-L1表達(圖2f)。大部分CD8+ T細胞呈PD-1陽性。調節性T (Treg)細胞和巨噬細胞散亂分布。治療后，腫瘤細胞變性疏松，呈巢狀結構。細胞外黏蛋白池周圍可見大量免疫細胞，尤其是CD8+細胞。許多間質細胞為PD-L1陽性，而腫瘤細胞仍為PD-L1陰性。此外，部分巨噬細胞與腫瘤細胞距離較近。在兩例非MPR患者(P10和P20)中，治療后也有CD8+ T細胞浸潤，但程度低于P18。治療前后標本中巨噬細胞增多，Treg細胞富集。WES和TCR測序顯示，MPR治療后標本中腫瘤突變負擔(TMB)和腫瘤新抗原負擔(TNB)下降(圖2g-h)，超擴張T細胞克隆擴增(圖2i)。
圖2：病理結果
3. 基因突變與新輔助治療療效之間的聯系
與TCGA STAD隊列一致，該隊列中最常見的發生突變的基因是TTN、TP53、SPTA1等(圖3a)。某些突變在同一患者新輔助治療前后同時存在，可能導致對治療的耐藥性(圖3a)。基線時，MPR中的TMB和TNB明顯高于非MPR腫瘤(圖3a, b)。由于MSI-H與高突變負荷之間的聯系，作者排除了MSI-H患者進行進一步的分析，發現MPR中的TMB和TNB高于非MPR腫瘤，但無統計學意義(圖3c)。治療后，整個人群的TMB顯著下降，排除MSI-H或MPR患者后也明顯下降(圖3d)。考慮到TMB和腫瘤純度之間可能的關聯，作者進行了模擬來平衡處理前和處理后樣本之間的腫瘤純度。模擬后，這些患者腫瘤純度調整后的TMB仍有顯著下降(圖3e)。為了更好地理解在治療下進化過程中的突變選擇，作者使用 “dNdScv”來估計非同義突變和同義突變的相對比率(dN/dS)，發現PPR患者治療后dN/dS顯著下降，提示陰性選擇和亞克隆多樣性降低。
在80%和80%的MPR基線樣本中發現了RREB1和SSPO突變，但在0%和7%的非MPR樣本中分別發現了RREB1和SSPO突變，這可能提示著二者可作為預測治療的生物標志物 (圖3a)。在TCGA STAD隊列中，SSPO突變患者可顯著延長了生存期，但在泛癌癥隊列中卻沒有(圖3f)。
根據治療前到治療后腫瘤VAF純度校正的變化，非同義突變被分為四種亞型，“增益”(僅發生在治療后樣本)、“丟失”(僅發生在治療前樣本)、“增加”(治療后VAF增加)和“減少”(治療后VAF降低)。病理降期與“丟失”突變比例顯著相關(圖3g、3h)。
圖3： 新輔助治療后的基因組特征和克隆進化
4. 不同應答患者的差異基因表達差異
接下來，作者分析了轉錄組數據及其與應答的關系。作者在MPR和非MPR患者的基線樣本中鑒定了209個差異表達基因(DEGs)。這些DEGs主要富集在維生素和脂肪代謝、細胞間/基質粘附、I3K-Akt、MAPK、Ras和Wnt等多種信號通路中(圖4a, b)。
在基線水平上，PPR樣本中的免疫檢查點基因(如CD274和CTLA4)和細胞毒性基因(如GZMB、NKG7和PRF1)水平明顯高于非PPR樣本(圖4c、d)。在PPR患者中，新輔助治療抑制了CD274、FOXP3、IDO1等免疫抑制基因，上調了CD8A、GZMH等細胞毒性基因，但這些差異無統計學意義(圖4e)。
通過免疫相關的特征分析，發現在基線水平上，PPR患者的細胞毒性、IFN-γ和T細胞衰竭明顯高于非PPR患者。新輔助治療促進了PPR和非PPR患者的細胞毒性和CD8+效應信號，但沒有顯著性(圖4f、g、4h)。
圖4：不同反應患者的轉錄組特征
5. 不同應答患者的腫瘤微環境（TME）差異
該研究使用xCell用于估計TME中的23種免疫細胞類型(圖5a)。在PPR腫瘤中，治療后DC、CD8+ T細胞、T輔助細胞和M1巨噬細胞的比例增加，而Treg細胞減少(圖5c)。在非PPR腫瘤中，DC、CD8+ T細胞和M1巨噬細胞的變化相似，但只有2例患者Treg細胞減少，4例患者Treg細胞上調Treg細胞(圖5d)。隨后，使用CIBERSORT確認了上述細胞的動態變化，并提供了細胞亞型的信息(圖5b)。例如，M1和M2型巨噬細胞顯著增加，而M0型巨噬細胞減少，反映了治療期間從M0到M1/2的譜系分化(圖5b)。
此外，作者還發現，在治療過程中，所有PPR和非PPR (P03、P04、P08、P15和P20)腫瘤從“耗竭型”或“纖維化型”轉變為“免疫型”或“免疫/纖維化型”(圖5e)。他們還發現新輔助治療后，所有PPR患者和部分非PPR患者(如P04、P08、P20、P21) 的效應細胞(EC)和MHC評分均升高(圖5f)。然而，抑制細胞(SC)和免疫調節劑(CP)在這些非PPR患者中顯著增加，而在PPR患者中保持穩定(圖5f)。其余非PPR腫瘤(P07、P08、P11、P12、P15)治療后無明顯變化。
圖5：免疫細胞反卷積及其與新輔助治療反應的關系
6. 治療期間T細胞克隆和TCR免疫組庫的動態變化
隨后，作者分析了這些患者的外周T細胞免疫組庫(TCR)。結果顯示，來自同一患者的樣本共享的TCR序列最多，而不同患者之間共享的TCR只有一小部分(圖6a)。然后，他們比較了4例PPR和6例非PPR患者TCR克隆性的動態變化(圖6b)。作者根據前20個T細胞克隆的頻率變化定義了克隆擴增(CE)評分。CE評分與病理降期顯著相關;4例PPR患者均為陽性，6例非PPR患者均為陰性(圖6c)。這表明應答者的T細胞克隆顯著擴增，由此，作者推測CE評分可能是治療應答的一個候選生物標志物。
作者還根據TCR頻率將每個樣本中的T細胞克隆分為四類，小(≤0.0001)、中(0.001-0.0001)、大(0.01 - 0.001)和超擴增(>0.01)(圖6d)。在PPR患者中，治療后超擴張克隆的頻率顯著升高，而小克隆的頻率則降低(圖6e)。在非PPR患者中未觀察到這些差異。這些結果進一步表明，T細胞克隆擴增患者的病理反應優于其他患者。此外，作者研究了TCR 的V和J基因片段的使用情況(圖6f, g)。治療過程中觀察到不同程度的V、J使用變化。TRBV20-1(圖6f)和TRBJ -5(圖6g)在MPR患者(P16和P18)中同時出現，而在其他患者中沒有，這表明TRBV20-1和TRBJ -5可能有助于抗腫瘤免疫。
圖6：T細胞免疫組庫和動態變化
四、總結
該項II期試驗中，作者的數據表明，基于ICI和抗血管生成的新輔助/轉化治療在cT4a/bN+胃癌，尤其是MSI-H和PD-L1陽性患者中具有良好的療效和可行性。如何提高其在MSS和PD-L1陰性患者中的療效有待進一步探索。多組學研究結果提供了一些候選的與療效相關的生物標志物，并幫助理解治療反應和耐藥的機制。
