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當油膩的“Meta”碰上純潔的“生信”，會擦出什么樣的火花？
哈嘍，大家好，今天為大家分享一篇發表在Molecular Therapy - Nucleic Acids雜志(IF：7.032)上的文章“A Chemoresistance lncRNA Signature for Recurrence Risk Stratification of Colon Cancer Patients with Chemotherapy”，本文中作者構建了化療耐藥性lncRNA的特征CRLSig預測模型。乍看題目，小編并不覺得其有什么奇特之處，但精讀之后，才發現妙不可言啊~，當油膩的“Meta”碰上純潔的“生信”，尤其是作者還使用了一種新型的蛋白質分析工具“Protemaps”，瞬間為文章增色不少，好奇的小伙伴和小編一起來學習下吧~
數據來源：
TCGA：https://portal.gdc.cancer.gov
GEO：http://www.ncbi.nlm.nih
篩選標準：
1)含有總體/無復發生存數據；
2)含有化療及其他療法信息；
3)樣本量超過50名患者；
4)有臨床數據，如AJCCTNM分期、年齡和性別。
研究對象：
★共納入了1171名結腸癌患者(未接受化療715名，接受化療456名)。
★接受化療的患者作為訓練隊列（GSE103479(n=60)、GSE39582(n=240)和GSE72970(n=83)）。
★TCGA_COAD隊列中71名僅接受化療的患者作為外部驗證隊列。
★未接受化療的患者作為對照組GSE103479(n=70)、GSE39582(n=326)和TCGA_COAD(n=319)。
★SMC隊列（GSE132465）單細胞測序數據的65362個細胞。scRNA-seq數據中上皮細胞的CMS亞型也來自SMC隊列。
患者基線資料：
流程圖
結果展示
1.通過Meta-分析鑒定結腸癌患者中化療相關的lncRNA
使用GENCODE v25和RefSeq v79進行注釋，從GSE103479、GSE39582和GSE72970中共獲得了2456個獨特的lncRNA。然后，進行Cox比例風險回歸分析，檢測2456個lncRNA的RFS-相關風險比(HR，95%CI)，根據患者的TNM分期進行調整。為了獲得在接受化療患者中與RFS相關的lncRNA，使用Meta-分析固定效應模型匯總2456個lncRNA的HR，結果發現，177個lncRNAs在未化療患者中與RFS顯著相關，268個lncRNAs在化療患者中與RFS顯著相關（圖2A）。其中，在接受化療的結腸癌患者中，有55種lncRNAs被識別為穩定的化療耐藥lncRNAs（meta-HR>1，P<0.00）。這55個lncRNAs與化療患者顯正相關（圖2B）。化療相關lncRNA的預后值和β系數均顯示在圖2C和補充表S3中。
2.CRLSig的構建和驗證
為了更好地區分化療耐藥人群，選擇在化療患者中發現的預后顯著較差的lncRNA構建了名為CRLSig的化學抗性lncRNAs特征，如
其中i和j代表化療相關lncRNA的序列和總數，βi是相應lncRNA的系數，expi是相應隊列中lncRNA的標準化表達。
預后分析顯示，化療組結腸癌患者的RFS可通過CRLSig在這些隊列中顯著區分（圖3A-3C）。此外，在驗證集中，可以觀察到高CRLSig組和低CRLSig組之間的顯著差異（圖3D）。研究證明CRLSig可以區分高組和低組，即使患者接受了標準的輔助化療，該工具可仍用于識別接受化療的預后較好的患者或RFS高風險的患者。ROC分析顯示CRLSig預測結腸癌預后的AUC分別為GSE39582（0.58-0.65）、GSE72790（0.73-0.75）、GSE103479（0.46-0.65）和TCGA_COAD（0.71-0.83）（圖3E-3H）。復發狀態隨CRLSig增加的直方圖也顯示了相同的趨勢（圖3I-3L）。
3.結腸癌化療患者CRLSig亞組分析
進一步測試了GSE39582、GSE72970和TCGA_COAD隊列中不同TNM分期的CRLSig預后值（GSE103479的患者均為II+III期，無IV期），以評估CRLSig的準確性和有效性，盡管已經構建了基于TNM調整后的CRLSig，結果發現在訓練隊列（GSE72970和GSE39582）和驗證隊列（TCGA_COAD）（圖4A-4F）中，II+III期或IV期患者的高和低CRLSig組的RFS仍存在顯著差異。
4.CRLSig對化療治療反應的預測
考慮到55個lncRNAs可能會降低化療的有效性，作者驗證了CRLSig對TCGA隊列（n=71）患者化療反應的預測值。條形圖顯示CRLSig評分隨著SD/PD的增加而增加（圖5A）。直方圖的卡方檢驗還發現CRLSig與化療反應之間存在顯著關聯（圖5B）。SD/PD狀態化療患者的CRLSig評分高于PR/CR狀態患者（圖5C）。ROC分析顯示，使用95%CI的CRLSig預測PR/CR的AUC為0.731(0.554-0.878)（圖5D）。
5.TCGA_COAD中低和高CRLSig之間的通路富集分析
在這里，作者采用了一種新的蛋白質定量數據分析工具“protemaps”，該工具能夠展示蛋白質的定量組成，重點是蛋白質的豐度和功能。在蛋白質圖譜中，每個蛋白質都顯示為一個多邊形，功能相關的蛋白質出現在相鄰區域，區域大小代表蛋白質豐度高低。
根據KEGG通路分析顯示，對化療有反應患者的代謝基因比例高于無反應患者（圖5E-5F）。此外，低CRLSig患者一部分代謝基因與對化療有反應的患者相似（圖5G-5H）。因此，在反應組或低CRLSig組中，較高水平的代謝RNA占主導地位。
為了觀察這些患者的代謝特征，作者進一步收集了先前研究的113條代謝途徑，并在本研究中對接受化療的TCGA_COAD患者進行了GSVA分析(基因集變異分析)。通過比較化療患者的高/低CRLSig組或CR、PR/PD、SD組，發現PR/CR患者和低CRLSig患者分別有27和25條代謝途徑被激活。其中，尿素循環、丙酮酸代謝和硫辛酸代謝等17條代謝途徑在PR/CR和低CRLSig組中均被激活（圖5I和圖5J）。
6.CRLSig與其他臨床病理因素的獨立性及其臨床特征
為了確定CRLSig的預后價值是否獨立于訓練和驗證隊列中的其他臨床病理因素，作者使用單變量Cox回歸分析來測試CRLSig的性能（補充表S7）。同時進行了多變量Cox回歸分析，結果顯示CRLSig在訓練隊列和驗證隊列中均與RFS顯著相關（圖6A）。作者還測試了TCGA隊列中CRLSig與其他臨床病理因素之間的關系。除了OS和RFS，CRLSig還與結腸癌化療患者的TNM分期顯著相關（圖6B）。在TCGA驗證隊列CRLSig與OS顯著相關（圖6C）。
為驗證CRLSig在其他接受化療的癌癥患者中的應用價值，作者對接受化療的18種癌癥患者進行CRLSig的Cox回歸分析，發現在PAAD和STAD隊列中，采用CRLSig評分可以將患者分為兩組，預后顯著不同（補充圖S6A-S6C）。
7.CRLSig的微環境特征
在TCGA隊列中，作者通過xCellR包獲得了大量接受化療的結腸癌患者的免疫浸潤細胞。結果發現，自然殺傷T(NKT)細胞與CRLSig顯著相關。其他免疫細胞，包括巨噬細胞、CD8+幼稚T細胞、CD8+T細胞和CD8+Tcm，與CRLSig呈負相關（圖6D）。一些趨化因子和細胞因子受體基因，如CSF2RB、CXCL14和CXCL9，也與CRLSig呈負相關（圖6E）。
此外，作者在GSE132465的單細胞測序數據中計算了65362個細胞中的CRLSig，發現與其他細胞相比，基質細胞中的CRLSig值更高（圖6F-6G）。共識分子分型(CMS)為結直腸癌提供了生物學上合理的分層。為了在單細胞水平上探索CRLSig與CMS亞型之間的關系，作者使用之前的scRNAseq數據發現，CMS1和CMS4亞型在腫瘤上皮細胞中比其他CMS亞型具有更高的CRLSig（圖6H）。
結語
結腸癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，結腸切除術與輔助化療和放療相結合，被公認為結腸癌的標準治療方法。雖然化療是有益的，但結果差異很大。此外，還沒有開發出有效的臨床預測因子來確定哪些結腸癌患者將從化療中受益，這也表明適當的患者分層的重要性。在本文中，作者提出了一種基于長鏈非編碼 RNA (lncRNA) 的結腸癌患者化療預測模型，從而期望能夠提供更好的患者分層，進而實現更有效的個性化化療。所以說呢，雖然分析的方法和套路都大同小異，但是作者的研究還是具有一定的臨床意義的，作者還結合了meta分析和生信分析兩種大數據分析工具，在經典的基礎上進行創新，不就是我們應該追求的嗎？
參考文獻:
Hao Wang, Yuzhen Gao, Somayeh Vafaei, Qiaoyan Yu, Jun Zhang, Liangjing Wang,A Chemoresistance lncRNA Signature for Recurrence Risk Stratification of Colon Cancer Patients with Chemotherapy,Molecular Therapy - Nucleic Acids,2021,ISSN 2162-2531,https://doi.org/10.1016/j.omtn.2021.12.015.
