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大家好呀，今天分享的文章題為動態scRNA-seq分析揭示多發性骨髓瘤中與微環境重塑和藥物敏感性相關的特異的腫瘤進程，于今年一月發表在《Cell & Bioscience》（IF = 9.584）上，文章有許多創新之處，讓我們一起學習一下吧！
一、摘要
多發性骨髓瘤（Multiple myeloma（MM））是一種以惡性漿細胞克隆性增殖為特征的血液系統惡性腫瘤。 盡管進行了廣泛的研究，但MM中驅動藥物敏感性和臨床結局的分子機制仍然難以捉摸。目前，使用蛋白酶體抑制劑（proteasome inhibitors（PIs））、免疫調節藥物（immunomodulatory drugs（IMiDs））和單克隆抗體等治療可有效緩解新診斷的MM（newly diagnosed MM，NDMM）的疾病嚴重程度并延長患者生存時間。本篇文章采用scRNA-seq技術研究了MM個體在硼替佐米-環磷酰胺-地塞米松（VCD）治療前后的腫瘤異質性和分子動力學。發現在2個周期的VCD治療后，未折疊蛋白反應（UPR）和代謝相關程序減少，而應激相關反應和免疫反應程序增加。同時發現腫瘤細胞免疫反應程序的低表達與MM中不利的藥物應答和低生存率相關，這可能是由于MHC I類介導的抗原呈遞和免疫監視的標記物下調以及與免疫逃逸相關的標記物的上調導致的。此外，結合免疫細胞譜分析，作者揭示了腫瘤內在免疫反應程序與微環境中免疫抑制表型之間的聯系（其證據是T細胞、NK細胞和單核細胞的耗竭狀態以及檢查點分子和抑制基因的表達）。值得注意的是，YBX1的表達與骨髓瘤中免疫激活信號的下調和免疫細胞浸潤的減少相關，從而導致不良預后。
二、結果
1、MM患者vs健康對照的單細胞表達圖譜和細胞分型
使用10× Genomics對10名MM患者和3名健康對照的骨髓（Bone Marrow（BM））和外周血（PB）進行單細胞測序分析。MM患者采用VCD方案治療，并在治療后2個周期收集配對樣本。共收集22份PBMC和22份骨髓單核細胞（BMMC）并進行scRNA-seq分析。去批次效應和質量篩選后共獲得241440個高質量單核細胞，并根據標記基因鑒定了13種主要細胞類型。通過UMAP對細胞進行聚類發現免疫細胞和漿/骨髓瘤細胞明顯分離，根據漿細胞的標記基因進行打分，漿/骨髓瘤細胞的得分更高。隨后，作者分析了25231個漿細胞和216209個免疫細胞，并對MM中的腫瘤和免疫細胞異質性進行了綜合分析。結果表明：一些前體細胞在BM中富集，而其他主要的免疫細胞都在PB中富集。還發現在接受VCD治療的患者中，除了漿細胞外，B細胞的比例也降低了（基于免疫調節藥物的治療后的MM患者中發現同樣的結果）（圖1：A-C）。
2、MM中腫瘤間和腫瘤內異質性的識別
為了比較正常漿細胞（nPCs）和骨髓瘤細胞，本文將PC重新劃分為20個不同的簇，結果顯示MM患者之間存在很強的異質性，而來自健康對照的nPCs和少量MM細胞聚類在一起（cluster15），表明MM樣本中存在nPCs。因此，作者通過CNV來區分骨髓瘤細胞和nPCs，使用來自健康對照的nPCs作為參考，估計了拷貝數的改變（CNAs），通過這種方式很好的區分了骨髓瘤細胞和nPCs。骨髓瘤細胞高度表達眾所周知的驅動基因，包括CCND1、NDS2/MMSET、CCND3，通路分析顯示，骨髓瘤細胞中多種生物學過程和通路顯著上調，隨后基于基因表達的層次聚類將骨髓瘤細胞分類為與其細胞遺傳學一致的轉錄亞型。這些結果表明，骨髓瘤間的異質性可以通過眾所周知的致癌驅動基因和不同的轉錄特征來解釋（圖1：D-E）。
為了進一步研究腫瘤內異質性（ITH），分別對每個MM患者的PCs進行聚類分析，并結合它們的CNA來檢測總體ITH。CNA數量與細胞簇數量沒有明顯的相關性。接下來，作者通過每個MM患者的基因表達譜定義患者腫瘤細胞的ITH評分，發現每個患者的ITH評分明顯不同。然而，平均ITH評分與聚類數或CNA均沒有顯著的相關性。用更大的數據集進行分析發現，復發MM的ITH評分明顯高于新診斷的患者（NDMM）。生存分析顯示，較高的ITH評分與較差的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）相關。總之，ITH可以預測臨床結果。
3、四種惡性細胞程序在治療后發生失調
藥物誘導的變化可能揭示化療藥物作用的分子機制，通過研究VCD治療前后骨髓瘤細胞的整體基因表達譜，發現每個患者都表現出不同程度的腫瘤細胞豐度減少。ITH評分在治療后也顯示出明顯的減少，可能是由于腫瘤細胞的消除。比較每個病人驅動基因，發現驅動基因表達減少與藥物反應之間存在潛在聯系。由于腫瘤間存在異質性，本文分別測定了同一受試者中每個治療前和治療后的腫瘤細胞之間的差異表達基因（DEGs）。對DEGs進行功能富集分析，并確定了化療后MM患者共享的4個功能模塊，包括UPR、代謝相關、應激相關和免疫反應。UPR和代謝的表達在處理后的樣本中持續減少。應激反應得分在治療后顯著上升，表明化療引起腫瘤細胞的應激反應，反過來可能有助于骨髓瘤抗凋亡和從藥物靶向中恢復從而導致抗藥；免疫反應激活途徑相關的各種基因治療后上調，表明治療誘導的抗骨髓瘤免疫反應是由多種途徑激活介導的。通過對腫瘤特異型調控網絡的分析，發現了與治療相關的關鍵轉錄因子（TFs），例如，XBP1和STAT3的調控活性降低，而治療后的UPR和IL6-STAT3信號通路降低。相反，FOSB、MYC及其翻譯調控因子YBX1在治療后調控活性增加。其他與表觀遺傳調控相關的活性上調的轉錄因子（EZH2、SMARCA4和SETDB1）表明在治療過程中存在染色體重塑（圖2）。
4、低免疫反應程序預測MM的不良藥物反應和預后
為了研究治療后應激和免疫反應程序的增加是否在大隊列中的疾病進展和治療耐藥性中發揮作用，本文對大量的MM樣本隊列進行評估，發現應激對患者預后的影響有限，因此作者關注的是免疫反應特征。通過對本研究中的腫瘤細胞進行評分，發現硼替佐米標準患者的免疫反應評分比良好的患者明顯降低，這表明低免疫反應可能會影響藥物敏感性。然后本文進一步測試了這一特征是否能影響患者的預后，發現低免疫反應評分與更差的OS和無進展生存期（PFS）顯著相關。這些結果共同表明，免疫反應程序與不良的藥物反應有關，從而導致腫瘤具有低水平的這種細胞狀態的患者預后較差（圖3）。
5、免疫反應較低的腫瘤細胞表現出免疫逃逸表型
在觀察了免疫反應對MM臨床結果的影響后，又探索了具有離散免疫反應評分的腫瘤細胞的轉錄譜，并確定了它們可能導致不良預后的差異。初步測定了每個患者的腫瘤細胞中免疫反應基因的表達評分，并根據評分將患者分成了高低兩組。然后對兩組進行通路分析，發現免疫反應評分低的腫瘤多種免疫反應通路下調，包括TNFα和IFN信號通路；而與細胞分裂、MYC信號通路和代謝過程相關的轉錄網絡表達上調，為了進一步證實這種“免疫排斥”表型，又檢測了調節免疫監視的基因的表達，發現MHC I類分子的表達顯著降低，從而導致低免疫反應性腫瘤中的免疫監視受損。本文還檢測了免疫抑制基因的表達，發現在低免疫應答骨髓瘤中免疫逃逸評分增加（CD47、LGALS1和TGFB1高表達）。這些結果表明，這些腫瘤具有活躍的細胞生長和增殖，以及逃避免疫補救細胞死亡的高能力（圖4）。
6、腫瘤微環境中功能失調的免疫細胞的特征分析
本文探討了治療前后主要免疫細胞群體的變化，對每種細胞類型治療前后的DEGs進行分析發現，大多數免疫細胞中IFN應答基因、應激相關基因表達下調以及相關通路下調；然而組蛋白相關基因在治療后免疫細胞中上調；T細胞中的細胞毒性標志物，以及骨髓亞群中的促炎基因在治療后表達上調。本文提取了MM中T細胞簇并劃分成11個亞群，與高免疫應答腫瘤相比，CD8效應T細胞和IFN應答T細胞與NK細胞一起表現出明顯的衰竭。此外，單核細胞在這些患者中也顯示出免疫檢查點和逃逸基因的表達增加。為了驗證腫瘤內在免疫反應信號與T/NK細胞功能之間的關系，作者從這些患者（GSE161801）中有配對免疫細胞的多發性骨髓瘤（RRMM）患者中提取了骨髓瘤細胞，并分析了本研究數據集中識別的特征。結果顯示，骨髓瘤細胞的免疫反應激活特征與CD8+細胞毒性T細胞（T_CD8_tox）的共刺激評分、NKdim、CD8+效應記憶T細胞和γδT（gdT）細胞的細胞毒性評分呈正相關；相反，腫瘤細胞中呈負相關。這些數據表明，腫瘤中免疫激活的早期減少持續到復發階段，而CD8+效應T、NK和γδT細胞在免疫排斥腫瘤微環境（TME）中的功能受損有助于骨髓瘤細胞的免疫逃逸（圖5）。
7、YBX1參與了MM的免疫應答、免疫細胞浸潤和臨床結果
鑒定了一個轉錄因子YBX1（Y-box結合蛋白-1，YB-1），該TF在低免疫反應狀態的骨髓瘤細胞中上調，與MHC I類分子的表達呈負相關，而與免疫抑制基因LGALS1和TGFB1的表達呈正相關，這些都表明YBX1可能是調節免疫反應程序的一個潛在因素。與非常好的部分緩解（VGPR/PR）患者相比，穩定疾病（SD）患者在基線和2個治療周期中的腫瘤中均有YBX1表達上調。分析來自GSE161195數據集中原發性難治性MM（PRMM）的患者，驗證了YBX1高表達與低藥物反應之間的相關性。生存分析結果顯示YBX1的高表達顯著預示了MM患者較差的OS和無進展生存期（PFS）。同樣，對CoMMpass隊列進行了GSEA分析結果顯示，與低YBX1組相比，MM高表達YBX1組的造血干細胞分化、mTORC1信號通路、MYC靶點、細胞周期等多種生物學過程均上調。相比之下，YBX1高表達組中涉及免疫應答激活的通路被下調。通過對CoMMpass隊列進行ssGSEA分析發現，與YBX1高表達的患者相比，CD4+/CD8+記憶T細胞，γδT，NK，多個髓系亞群和B細胞在YBX1低表達的患者中明顯降低。
為了驗證本研究中scRNA-seq數據中關于YBX1在MM中的功能的結果，作者進一步對人骨髓瘤細胞系（HMCLs）和原發性骨髓瘤樣本進行了體外實驗。敲除YBX1后，U266、OPM2和RPMI-8226的細胞增殖顯著下降。同樣，在抑制YBX1后，原發性骨髓瘤細胞的細胞活力下降。通過體外共同培養發現了降低YBX1的表達使T細胞和骨髓瘤細胞相互總用增強。這些結果重現并驗證了本研究在scRNA-seq分析中觀察到的基因表達模式，并表明YBX1通過去除T細胞功能和促進免疫抑制來促進其對骨髓瘤生存和藥物反應的影響（圖6）。
三、小結
本研究使用scRNA-seq揭示了MM的異質性惡性腫瘤和微環境變化，并基于治療前和治療后的動態分析識別了特異性轉錄組，MM在治療過程中的分子和細胞復雜性，并為藥物反應和治療選擇提供了潛在的分子生物標志物。本研究有4個亮點：1、作者對患者治療前和治療后的樣本進行單細胞測序研究，很好地比較了每個細胞簇治療前后差異基因的功能特征。2、當作者發現MM和漿細胞高度相關時，通過對漿細胞簇的重新聚類以及使用CNA區分患者中正常的漿細胞和非正常漿細胞。3、應用免疫評分量化免疫微環境并確定了低免疫評分和免疫逃逸相關。4、最后，作者通過體外培養確定了YBX1通過去除T細胞功能和促進免疫抑制來促進其對骨髓瘤生存和藥物反應的影響。
參考文獻：Chen M, Wan Y, Li X, Xiang J, Chen X, Jiang J, Han X, Zhong L, Xiao F, Liu J, Huang H, Li H, Liu J, Hou J. Dynamic single-cell RNA-seq analysis reveals distinct tumor program associated with microenvironmental remodeling and drug sensitivity in multiple myeloma. Cell Biosci. 2023 Jan 30;13（1）:19. doi: 10.1186/s13578-023-00971-2 . PMID: 36717896 ; PMCID: PMC9887807 .
