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大家好呀！今天要給大家分享的是發表于PNAS（IF：11.205）上的一篇文章。話不多說，我們一起來看看吧~

致病性 TNF-α 在 Aire 缺陷型自身免疫模型中驅動周圍神經炎癥

背景介紹

1. TNF α

腫瘤壞死因子-α. （TNF-α）是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產生的促炎細胞因子，參與正常炎癥反應和免疫反應。其主要作用是調節免疫細胞的功能。

2. 疾病介紹

格林－巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）和慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病 （chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy，CIDP）都是周圍神經系統 (PNS) 的炎癥性疾病，臨床特征包括虛弱、感覺喪失、反射消失和疼痛等。GBS 和 CIDP 是由涉及細胞和體液因素的周圍神經髓鞘的自身免疫性破壞引起的，但這種自身免疫性破壞對周圍神經髓鞘的免疫耐受的確切機制尚不明確。目前常見的臨床治療僅限于非特異性作用機制的治療手段，如靜脈注射免疫球蛋白、糖皮質激素和治療性血漿置換等。

3. NOD.Aire^GW/+小鼠介紹

在非肥胖性糖尿病（NOD）遺傳背景下，攜帶顯性功能喪失 Aire G228W 突變的小鼠（NOD.Aire^GW/+小鼠）會出現自發性自身免疫性周圍多發性神經病（SAPP），概括了 GBS 和 CIDP 的多個特征。由于 SAPP 和人類炎癥性神經病之間的多個共同特征，該小鼠模型是了解炎性神經病致病機制的常用模型之一。

數據組成

1. 本研究中產生的NOD.Aire^GW/+小鼠scRNA-seq數據（GSE180498）；
2. 已發表文獻中的野生型 C57BL/6 (B6.WT) 和 NOD (NOD.WT) 小鼠scRNA-seq數據（GSE142541）；
3. 已發表文獻中的巨噬細胞的scRNA-seq數據（GSE142541和GSE144708）。

結果

1. 神經性 NOD.Aire^GW/+小鼠坐骨神經中的異質免疫細胞中多種細胞因子通路上調

為了解坐骨神經中的免疫細胞組成，研究人員對來自神經性 NOD.Aire^GW/+小鼠坐骨神經的免疫細胞進行scRNA-seq分析（圖 1A），共鑒定出11 個免疫細胞群，包括有CD4+ T 細胞、CD8+ T細胞、調節性T細胞、γδ T 細胞、自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞、B細胞、漿細胞以及巨噬細胞等（圖1B-D）。流式細胞分析結果顯示，T 細胞（包括 Cd4、Cd8 和 Treg）是構成坐骨神經浸潤免疫細胞的主要細胞群，其次是 B 細胞、巨噬細胞、cDC和pDC等細胞（圖1E）。圖 1 F-H結果顯示，IFN-γ 反應和通過 NF-κB的TNF-α 信號傳導途徑在骨髓組（cDC 和巨噬細胞）細胞中表達顯著，且巨噬細胞高度表達通過 NF-κB的TNF-α信號傳導通路中的相關基因。綜上，研究人員推測骨髓細胞中顯著存在的TNF-α 介導的信號傳導可能在 SAPP 發展中起重要作用。

2. IFN-γ 由 T 細胞表達并誘導NOD.Aire^GW/+巨噬細胞中的 TNF-α 表達。

細胞通訊分析結果顯示，IFN-II（也稱為 IFN-γ）和TNF 信號通路網絡是免疫細胞群之間重要的信號通路，CD4+ 和 CD8+ T 細胞為IFN-γ 主要的來源細胞，骨髓細胞群為IFN-γ主要的靶細胞（圖 2A-C）。圖 2 D-F結果顯示，巨噬細胞是TNF-α 的主要來源，多種免疫細胞類型（包括巨噬細胞本身）是 TNF-α 靶細胞。同時，圖 2G流式細胞分析結果顯示，TNF-α 蛋白主要由 F4/80⁺ 巨噬細胞表達。與非巨噬細胞群相比，F4/80⁺ 巨噬細胞中 TNF-α 表達的平均熒光強度顯著更高（圖 2H）。據報道，IFN-γ 可誘導巨噬細胞中的 TNF-α 表達，故研究人員推斷由NOD.Aire^GW/+小鼠神經中的 T 細胞產生的 IFN-γ 可能是刺激巨噬細胞 TNF-α表達的信號。為驗證其猜測，研究人員從NOD.Aire^GW/+ 小鼠中分離出骨髓來源的巨噬細胞 (BMDM)，并在存在或不存在 IFN-γ 的情況下分別對其進行培養。實驗結果顯示，與未受刺激的 BMDM 相比，暴露于 IFN-γ 的 BMDM 中TNF-α 的表達顯著上調（圖2I）。

3. TNF-α介導的信號在自身免疫靶向的坐骨神經中上調

圖 3A流式細胞分析結果顯示，與NOD.WT小鼠相比， NOD.Aire^GW/+ 小鼠的坐骨神經中 CD45+ 免疫細胞數量呈指數增加。研究人員通過對來自穩態（B6.WT和NOD.WT）與自身免疫性（NOD.Aire^GW/+）小鼠的坐骨神經免疫細胞 scRNA-seq 數據進行組合分析，共鑒定出12 個主要免疫細胞群（圖 3B），其中Ctla4+ T 細胞僅來源于自身免疫性NOD.Aire^GW/+小鼠（圖 3C）。

研究人員接下來又對來自穩態和自身免疫性小鼠坐骨神經的免疫細胞之間的細胞信號模式進行比較分析。結果顯示，與 NOD.WT 相比，NOD.Aire^GW/+ 樣本中的信息流顯著增加，且僅在NOD.Aire^GW/+坐骨神經中鑒定出IFNII（IFN-γ）和TNF信號通路（圖 2 D）。TNF-α 信號通路中的TNFR1 和 TNFR2受體分別由Tnfrsf1a 和 Tnfrsf1b 編碼，圖2E-F結果顯示，Tnfrsf1a 在巨噬細胞和 cDC 細胞中表達顯著增加，Tnfrsf1b 在 T 細胞、gd/NK/NKT、混合和巨噬細胞群中顯著增加。此外，與 NOD.WT 相比， NOD.Aire^GW/+的巨噬細胞群中的 Tnf 表達增加（圖 3F），并通過RT-qPCR和免疫組化染色得到驗證（圖 3G-H）。

4. 自身免疫與損傷巨噬細胞的單細胞轉錄組特征差異

為進一步比較損傷和自身免疫性巨噬細胞的單細胞轉錄組特征變化，研究人員對來自損傷巨噬細胞和自身免疫性巨噬細胞的 scRNA-seq 數據進行整合分析。通過聚類分析共劃分出7個不同的groups，其中group 1和group 2的巨噬細胞主要來源于 D1 損傷巨噬細胞，group 3和group 4的巨噬細胞主要來源于 D5 損傷巨噬細胞（圖 4 A 和 B）。值得注意的是，group 7巨噬細胞中 Tnf 表達最高（圖4C）。GSEA分析結果顯示，通過 NF-κB 的 TNF-α 信號傳導是group 7巨噬細胞中最為顯著的信號傳導途徑之一（圖4D）。此外，擬時間分析結果顯示，group 7巨噬細胞為 D5 損傷巨噬細胞軌跡的延伸（圖4E），故研究人員推測其中發生的表型變化是從神經損傷修復結束時的修復狀態變為具有自身免疫的促炎狀態。

5. 自身免疫性周圍神經病通過抗 TNF-α 抗體治療和基因 TNFR 消融得到改善

研究人員為確定 TNF-α 是否是周圍神經自身免疫性脫髓鞘所必需的，通過在小鼠模型中進行抗體介導的 TNF-α 阻斷效果測試。結果顯示，雖然所有未經治療的 7 只小鼠都出現神經病變，但抗 TNF-α 抗體治療的 14 只小鼠中有 13 只成功預防神經病變（圖 5A）。H&E 染色和流式細胞分析結果顯示，抗 TNF-α 治療的NOD.Aire^GW/+小鼠的免疫浸潤顯著降低（圖 5 B 和 C）。

接下來，研究人員還遺傳方法驗證TNF-α 阻斷對 PNS 自身免疫發展的影響，構建了TNFR1 和TNFR2雙缺陷型NOD.Aire^GW/+小鼠（NOD.Aire^{GW/ +}Tnfrsf1a^-/- Tnfrsf1b^-/-）。實驗結果顯示，雖然所有NOD.Aire^GW/+小鼠（n = 16）在 30 周齡時出現神經病變，但NOD.Aire^{GW/ +}Tnfrsf1a^-/- Tnfrsf1b^-/-小鼠（n = 19）可以成功預防病變出現（圖 5E）。綜上結果顯示，通過用抗 TNF-α 抗體治療或通過 TNFR1 和 TNFR2的遺傳缺陷阻斷 TNF-α 活性，可防止自身免疫性周圍神經病變的發展。

6. TNFR1 促進 PNS 自身免疫并誘導NOD.Aire^GW/+巨噬細胞中多種自身免疫相關基因的表達

研究人員進一步探究了TNFR1 缺失對神經病變發展的影響，圖6A結果顯示，僅有TNFR1 缺失也可保護NOD.Aire^GW/+小鼠免受SAPP病變。H&E 染色和流式細胞分析結果顯示，來自 TNFR1 缺失型 (Tnfrsf1a^-/-) NOD.Aire^GW/+小鼠坐骨神經的免疫浸潤程度顯著降低（圖 6 B 和 C）。此外，對坐骨神經的神經傳導研究表明，TNFR1缺失可防止脫髓鞘（圖 6D）。

小結

本文通過單細胞 RNA 測序分析自身免疫攻擊期間神經中的免疫細胞，揭示了一個巨噬細胞介導的TNF-α信號網絡，該網絡在受自身免疫影響的坐骨神經免疫細胞中顯著上調。自身免疫相關 T 細胞產生IFN-γ，促進巨噬細胞中 TNF-α 的表達上調。相比之下，損傷后周圍神經巨噬細胞中 TNF-α 的表達和信號傳導會顯著降低，這表明最大限度地減少 TNF-α 活性可能是實施修復性巨噬細胞狀態的關鍵。事實上，TNF-α 信號的基因消融以及基于抗體的 TNF-α 阻斷，可以防止自身免疫性神經病變的發展。綜上所述，增加的 TNF-α 信號傳導是 PNS 自身免疫的一個決定性特征，可能將是一個有效的臨床治療手段。

參考文獻

Wang Y, Guo L, Yin X, McCarthy EC, Cheng MI, Hoang AT, Chen HC, Patel AY, Allard Trout D, Xu E, Yakobian N, Hugo W, Howard JF Jr, Sheu KM, Hoffmann A, Lechner MG, Su MA. Pathogenic TNF-α drives peripheral nerve inflammation in an Aire-deficient model of autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jan 25;119(4):e2114406119.