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大家好！今天要介紹的這篇文章說新也不新，說普通也不普通。scRNA-seq、EGFR突變、免疫治療這三個詞大家都耳熟能詳，這篇文章將這三點充分揉合在一起，揭示了EGFR突變塑造的肺腺癌免疫抑制微環境是免疫治療效果差的因素之一。行文間無不體現作者是肺癌領域的深耕者，因此，研究肺癌的同學要好好研讀了！另外，常見基因突變對腫瘤微環境的影響會不會成為你挖掘公共數據的思路呢~
文章標題
背景知識
免疫療法對EGFR突變的非小細胞肺癌(NSCLC)患者效果較差。其中，PD-L1低表達和腫瘤突變負荷是潛在機制。而腫瘤微環境(TME)是影響免疫治療的另一個重要因素，迄今尚未得到全面了解。因此，作者發起了這項研究，從細胞組成和功能的角度描述不同EGFR突變狀態下肺腺癌(LUAD)的微環境特征，以更好地了解其免疫情況。
結果解讀
肺腺癌的全局免疫景觀
為了評估EGFR突變的肺腺癌（LUAD）微環境的免疫景觀，作者從8名未接受過治療的LUAD患者收集了9個腫瘤樣本（5個EGFR陽性和4個陰性），用于單細胞RNA測序和生物信息學分析（圖1A）。兩個EGFR陽性樣本來自1名有多個結節的患者：一個為EGFRL858R，另一個為EGFR19del。
作者總共分析了40,799個單細胞，包括來自4個EGFR陰性樣本的18,704個細胞和來自5個EGFR陽性樣本的22,095個細胞，確定了八種主要細胞類型：上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、單核細胞、T/自然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞、B/漿細胞和肥大細胞。作者對每組和每位患者進行了全局細胞類型注釋（圖1B、D和E）。微環境中這些細胞類型的比例在EGFR陽性組和EGFR陰性組之間存在顯著差異（圖1C，D）。
比較有意思的是，EGFR陽性和陰性組中，T/NK細胞均占主導地位，且存在相似的比例。然而，EGFR陽性組的單核細胞、肥大細胞和內皮細胞的比例較高，而EGFR陰性組的中性粒細胞和成纖維細胞比例較高（圖1D）。
不同EGFR狀態的上皮細胞驅動微環境的多樣性
總共獲得9067個上皮細胞，分成13個簇（圖2A）。作者使用R包infercnv將上皮細胞分為腫瘤細胞和正常細胞（圖2D-D），并將>50%的腫瘤細胞群定義為腫瘤簇，將其他細胞群定義為正常簇。根據差異豐度測序（DASeq）分析，EGFR陽性組富集C1和C5，而EGFR陰性組富集C0、6、8和11。
富集分析結果顯示EGFR陰性組C6上調干擾素(IFN)α/γ響應和PI3K-AKT-MTOR相關信號通路（圖2E）。基因表達分析顯示，CCL18、CXCL1和CXCL3在EGFR陽性特異性簇中的表達高于陰性特異性簇（圖2F），與免疫抑制相關。而EGFR陰性特異性簇C6表現出CXCL5、IL-7、IL-18和IL-32的高表達（圖2F）。IL-7是CD8+記憶T細胞增殖所必需的，而IL-18是活化CD8+ T細胞存活和產生IFN-γ所必需的。因此，野生型EGFR的腫瘤細胞可能具有更強的促進CD8+ T細胞增殖的能力。
作者進一步將公共數據集中免疫治療后響應和非響應樣本的上皮細胞與本研究中EGFR陽性和陰性狀態的未治療樣本進行比較，EGFR陽性特異性簇C1和5與來自非響應患者的上皮細胞相同（圖2H）。這些結果與假設一致，即EGFR陽性LUAD可能對免疫治療反應不佳。
軌跡分析顯示，EGFR突變驅動正常上皮細胞分化為代謝特征不同的兩組：fate1（EGFR陰性組）或fate2（EGFR陽性組）（圖2I），說明代謝特征也可能對EGFR突變LUAD的微環境產生負面影響。
CD8+ TRM細胞在EGFR野生型LUAD中富集和激活，CD8+ TRM細胞可能通過CXCL13分泌促進三級淋巴結構的生成
作者把T和NK細胞分為CD8+ T細胞、CD4+ T細胞和NK細胞。接下來，CD8+和CD4+ T細胞分別分成9個和8個亞群（圖3A、C）。在EGFR陰性組中，CD8+ TRM細胞、CD8+循環T細胞、CD4+ TRM細胞和Th1樣細胞的比例較高（圖3B，D）。
CD103是TRM細胞的表面標志物，CD103+ CD8+ TRM細胞與多種癌癥免疫治療后生存率的提高有關。此外，許多抑制性免疫檢查點，例如PD-1、LAG3和TIM3在TRM細胞中高度表達。mIHC結果顯示，EGFR陰性組中CD103+ CD8+ T細胞的比例更高（圖3E）。此外，EGFR陰性組CD8+ T細胞中PD-1、LAG3和TIM3的表達較高。在scRNA-seq數據中，抑制性和激活性免疫檢查點在CD8+ TRM細胞中都高表達，而EGFR陽性細胞中不存在這些免疫檢查點（圖3F）。這些結果表明，CD8+ TRM細胞在EGFR野生型LUAD的TME中富集，與mIHC數據一致。
作者進一步研究T細胞分泌的細胞因子，發現CXCL13在EGFR陰性組的CD8+ TRM中表達較高（圖3G）。CXCL13介導B細胞向腫瘤的募集，對于三級淋巴結構(TLS)的形成至關重要，其密度是幾種癌癥類型對免疫治療反應的陽性預測因子。mIHC結果顯示，EGFR陰性組CD8+ T細胞中CXCL13的表達和TLS密度顯著高于EGFR陽性組（圖3E，H）；這種差異在基質區域更為顯著，表明CXCL13可能促進腫瘤基質區域的TLS形成。
為了驗證這一發現，作者分析了一個包含3個接受pembrolizumab治療的樣本的外部數據集。作者發現CD8+ TRM細胞在EGFR陰性組中的比例高于EGFR陽性組（圖3I-K）。在來自EGFR陰性組的每個樣本中都發現了CD8+ TRM細胞。此外，CD8+ TRM細胞是響應性結節的主要CD8+ T細胞（圖3I-J）。因此，基線腫瘤組織中CD8+ TRM的富集可能是對ICI反應的預測因素之一。
巨噬細胞可能在EGFR陰性LUAD中募集和擴增CD8+TRM細胞
作者將巨噬細胞分為8個亞群（圖4A、D）。EGFR陽性組肺泡巨噬細胞C1和C3的比例較高，而EGFR陰性組的CHIT1_TAM簇比例較高（圖4B）。DASeq分析表明EGFR陽性特異性區域與肺泡巨噬細胞C1和C3重疊，EGFR陰性特異性區域與CHIT1_TAM重疊（圖4C）。
基因表達分析顯示，EGFR陽性組巨噬細胞高表達CCL2、CCL13、GDF15、CCL23、CXCL17（圖4E），與EGFR突變的LUAD形成免疫抑制微環境有關。EGFR陰性組高表達CXCL9、CXCL10、CCL3、CXCL5、CXCL12，與抗腫瘤免疫響應有關。
在評估免疫治療后的既往數據時，整合的巨噬細胞主要分為肺泡巨噬細胞和TAM（圖4F）。作者分析了治療后的TAM，響應樣本的TAM特異性高表達CCL7、CXCL9和CXCL10，并與來自EGFR陰性初治組的TAM重疊（圖4G）。進一步分析TAM發現高表達的亞群CCL7_TAM（圖4H）。據報道，CCL7與人NSCLC腫瘤活檢中的CD103呈正相關，這表明EGFR陰性組中CCL7表達較高的巨噬細胞可能促進TRM擴增。
CAF可能有助于在EGFR野生型LUAD將CD8+ T細胞轉化為CD8+ TRM細胞
成纖維細胞分為8個簇，并標注為成纖維細胞、肌成纖維細胞和CAF（圖5A、B）。CAF是TME的核心元素，并與癌細胞和TME的其他成分相互作用。作者將CAF分為肌纖維母細胞CAF(myCAF)、抗原呈遞CAF（apCAF）和炎性CAF(iCAF)（圖5C、D）。EGFR陰性組的apCAFs、myCAFs-1和myCAFs-2的比例高于EGFR陽性組。兩組iCAF的比例相似（圖5E）。DASeq還顯示apCAFs、myCAFs-1和myCAFs-2的分布與EGFR陰性特異性細胞的分布重疊（圖5F）。apCAFs的Hallmark分析顯示該簇富含促炎途徑（圖5G）。
對初治和治療后樣本的進一步比較表明，在ICI治療后，成纖維細胞存在于非響應樣本中，但很少出現在響應樣本中。非響應樣本中的主要和次要細胞分別是LEPR+ CAF和myCAF（圖5H，I）。因此，殘留的LEPR+ CAF可能會導致免疫耐受。LEPR是間充質干細胞（MSCs）的標志物，LEPR+ CAFs可以被認為是MSC樣CAFs。未經治療的樣本中的iCAF和部分成纖維細胞與組合池中的LEPR+ CAF相關（圖5J）。進一步分析表明，這些殘留的CAF特異性表達MMP2、CXCL14、CXCL12、FAP、TNFSF13B、BMP5和HGF（圖5K）。與免疫抑制和治療耐受有關。
TGF-β信號傳導對于TME中MSCs分化為CAFs至關重要。作者發現EGFR陰性組的iCAF和myCAF比EGFR陽性組更能表達TGF-β。TME中豐富的TGF-β也可以誘導CD103在CD8+ T細胞表面的表達。因此，來自EGFR陰性組的CAF可能具有誘導CD8+ T細胞轉化為CD8+ TRM細胞的能力。
B細胞在EGFR陰性LUAD的構建TLS
B細胞分為10個簇（圖6A、B）。EGFR陰性組的漿細胞比例高于EGFR陽性組（圖6C）。免疫抑制因子CXCL17和GDF15的漿細胞表達在EGFR陽性組中較高，而與CAF激活有關的CCL18和GRN在EGFR陰性組中較高（圖6D）。
B細胞是TLS最重要和最基本的組成部分。細胞-細胞互作分析表明，B細胞可以通過與受體結合的各種細胞因子配體被CHIT1_TAM、iCAF和LAMP3+ DC募集（圖6E）。表達CCR7的B細胞可以通過分泌CCL21的CHIT1_TAM募集。EGFR陰性組的B細胞更高表達CCR7，同時CHIT1_TAM特異性表達CCL21（圖6F）。此外，與TLS形成的CD79A在EGFR陰性組的B細胞中比EGFR陽性組的表達更高（圖6F）。這些數據表明，來自EGFR陰性組的B細胞可能已被CHIT1_TAM募集，并有可能在TME中構建TLS。
細胞相互作用網絡因EGFR狀態而異
作者使用CellPhoneDB來研究LUAD微環境中的細胞間通信。細胞通訊類型因EGFR突變狀態而異。由于CD8+ TRM細胞可能是負責免疫治療療效的主要免疫細胞，作者分析了CD8+ TRM與其他細胞類型之間的特定相互作用（圖7A）。在EGFR陰性組中注意到CD8+ TRM細胞與CHIT1_TAM、LAMP3+ DC和成纖維細胞的相互作用。CHIT1_TAM可以通過CXCL9/CXCL10–CXCR3結合來吸引和激活TRM細胞。LAMP3+ DC可能通過EGFR陰性組中的IL-15和IL-15R結合促進TRM擴增和穩態存活。同時，我們的EGFR陰性組中的成纖維細胞也通過TGFB2-TGFBR2和TGFB3-TGFBR3結合與TRM特異性相互作用，這對于CD8+ T細胞上調CD103以轉化為TRM細胞是必不可少的。
接下來，作者又分析了配體、受體及其在不同EGFR狀態的兩個細胞亞群之間的相互作用。作者發現一些配體-受體對在EGFR陰性組和陽性組中共享，另一些為則出現在EGFR陰性組或陽性組中。關于免疫檢查點配體-受體對，與EGFR突變LUAD相比，EGFR野生型的T細胞與其他細胞類型（包括PD-1和PD-L1）之間存在更特異性的相互作用（圖7B-D）。IHC結果顯示EGFR陽性組中免疫檢查點的表達較低，包括PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、TIM3和CD47（圖7E）。值得注意的是，TIGIT在EGFR陽性組中表達更高，尤其是在基質中，而其他免疫檢查點的模式則相反（圖7E）。這些結果可能會為EGFR突變LUAD的潛在免疫治療策略提供見解。
結束語
本文最大的亮點是作者將肺癌中常見的EGFR突變和免疫治療響應結合起來，通過單細胞數據整合分析，證明了EGFR陰性與免疫治療響應樣本的共同特征。其中，以CD8+ TRM細胞（免疫響應相關）為主線，其他細胞類型圍繞這條主線進行詳細研究。
參考文獻
Yang L, He YT, Dong S, et al. Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma. J Immunother Cancer. 2022;10(2):e003534. doi:10.1136/jitc-2021-003534
