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腫瘤微環境中免疫激活和免疫抑制機制之間的平衡能夠預測腫瘤免疫檢查點抑制療法的療效。因此，今天小編就和大家分享一篇今年2月發表在BRITISH JOURNAL OF CANCER（IF：7.640）雜志上關于計算免疫激活與免疫抑制平衡得分的文章，做免疫的小伙伴不要錯過呀。
A balance score between immune stimulatory and suppressive microenvironments identifies mediators of tumour immunity and predicts pan-cancer survival
泛癌中識別腫瘤免疫介質及預測生存的免疫激活與抑制微環境的平衡得分
一． 研究背景
有研究發現腫瘤中高密度活化T細胞的活躍免疫微環境與良好的預后及免疫治療的應答有關。然而，目前癌癥免疫所進行的轉錄組學研究主要用的是基因特征或模塊，這種分析僅能捕獲一個或一組相互緊密連接或相關的過程。相較而言，同時分析激活和抑制這兩種免疫信號可能會更好地定義腫瘤免疫微環境的真實免疫狀態，這也有助于捕捉與免疫相關的相反信號之間的平衡。因此，今天介紹的文章就計算了一個免疫激活與免疫抑制的平衡得分（MIRACLE），并在泛癌中對得分的預后效能等進行了分析。
二． 數據及方法
1. 數據收集：研究從TCGA下載31種癌癥的表達數據及臨床數據。除了TCGA外作者還從GEO、 European Nucleotide Archive 及Short Read Archive下載相關數據，其中GEO數據集等被視為單獨的研究，即使被標注為相同的實體腫瘤隊列，也不會被合并。
2. 數據處理：1）RNA序列：研究使用Trim_Galore/CutAdapt處理原始fastq文件，接著使用STAR比對，然后使用GenomicAlignments Bioconductor的summarizeOverlaps函數得到原始的基因counts，最后對基因counts數據進行標準化。2）芯片數據：研究從GEO下載Affymetrix.CEL文件，并使用GEOquery包的justRMA 函數標準化。
3. 基因集富集分析：作者使用yaGST包進行單樣本基因集富集。其中預先計算的TCGA癌癥免疫景觀評分從相應的文獻下載。而評估免疫和基質特征從各自的出版物下載，這些特征中缺失數據或異常的被過濾。最終，在28個TCGA實體隊列的生存和相關分析中，共使用76個特征作為實體微環境中抗癌癥免疫反應的介質（MIRACLE）的基準。
4. 基于免疫排斥常數(ICR)的生存相關性隊列分層：研究使用連續的ICR基因特征的標準化富集評分(NESs)識別28個TCGA隊列的生存相關性。生存相關性為陽性的隊列被指定為ICR-Enabled(IE)隊列，而生存相關性為顯著陰性的隊列被指定為ICR-Disabled (ID)隊列。
5. 差異表達：為了確定IE和ID隊列中與ICR相關的基因組特征，作者根據第一和第三分位數的NES定義高富集和低富集水平，在ICR高富集和ICR低富集的樣本之間進行了有監督的差異表達分析。采用非參數Wilcoxon檢驗，對基因進行篩選，這些基因構成了IE和ID基因集。
6. 計算MIRACLE得分：研究中定義MIRACLE是給定樣本中IE和ID兩個top基因集的單樣本富集分數的比值。作者使用yaGST包中MWI-GST的NES，即NES是對基因在基因組中表達大于基因在基因組外表達的概率的估計：NES=1-U/m*n。其中m是基因集中的基因數目，n是基因集外的基因數，U=m*n+m(m+1)-T,其中T是基因集中基因的秩次數。
7. GO及網絡分析：研究中作者使用Cytoscape Suite中的BiNGO進行GO富集分析。作者使用Cytoscape EnrichmentMap在網絡圖中可視化GO富集并對BiNGO輸出進行了過濾。在網絡圖(richmentMap)中，節點的大小與基因集的大小成正比，而邊的粗細與GO條目的相關性成正比。
8. 生存分析：分析中作者采用單因素及多因素分析檢驗每個隊列中特征的預后價值。
9. ICI應答的定義及數據集：研究中將根據RECIST標準分類為進展性疾病的患者被視為無應答者，分類為完全緩解、部分緩解或穩定疾病的患者都被視為應答者。ROC曲線和AUC值使用pROC包根據計算。
三、研究的主要內容及結果
1. 免疫平衡得分在預測泛癌癥生存方面優于先進的免疫特征
在文章的第一部分作者使基于ICR使用圖1a的方法開發了一個平衡得分。研究首先從TCGA數據庫中識別出具有高度活躍免疫表型且有利的生存相關及表型與生存不利相關的癌癥類型。 作者將這兩組癌癥類型分別分為ICR-enabled（IE）和ICR-disabled(ID)組。而與其他ICR沒有顯示相關性的癌癥類型被歸類為中性ICR組(ICR-neutral)。接著在IE腫瘤中對ICR高表達的樣本與ICR低表達的樣本之間進行監督分析，結果識別1493個差異表達基因。接下來作者對ID腫瘤進行同樣的分析，獲得了1265個差異表達基因。其中兩個組有888個共出現基因，有605個與ICR特征正相關的基因只在IE隊列中，377個與ICR特征正相關的基因只在ID隊列中(圖1a)。研究中作者關注最后兩個列表，并根據基因在兩個監督分析中的差異表達進行排序，及根據基因在兩個列表中的差異排秩對每個基因進行評分。對于IE特異性列表中的每個基因，計算ΔRIE = RIE-RID，其中RIE和RID分別是該基因在IE和ID差異表達列表中的排秩。通過ΔRIE重新排秩的top基因被保留進一步分析。同樣，ID特異列表中的基因按照相反的方法進行評分ΔRID = RID-RIE。MIRACLE得分是IE和ID特異基因集合中按ΔRIE和ΔRID排秩的top基因的NESs之比(圖1b)。接下來作者發現在TCGA隊列中，MIRACLE得分具有很高的預后效能(圖1c)。接著作者將MIRACLE得分與最近在泛癌研究中報道的76種不同的免疫評分相比，發現在TCGA中MIRACLE是最顯著的生存預測因子。同時作者也進行多因素分析，研究MIRACLE預后價值的獨立性。
2. MIRACLE評分將炎癥與基質評分/TGFβ信號通路和其他免疫抑制信號解耦
由于MIRACLE是由ICR信號誘導的DEGs衍生而來，因此，在文章的第二部分作者通過評估它們與一組免疫相關指標的相關性來分析這兩個評分之間的差異（圖2）。結果發現ICR(圖2a)與T細胞浸潤的其他特征等高度相關。此外，ICR與免疫抑制信號也具有適度但一致的相關性。而MIRACLE(圖2b)評分與這些抑制特征不相關或反相關，與Th1極化T細胞浸潤的所有特征高度相關。接下來為了更好地闡明定義的MIRACLE評分特征的功能作用，作者對IE腫瘤特異性基因和ID特異性基因進行了GO富集分析（圖3），結果發現在這些GO條目的自組織網絡圖中，IE和ID特征反映了兩個對立的網絡。
3. 與MIRACLE評分相關的基因組學事件
在文章的第三部分作者分析了特異性致癌突變與MIRACLE評分的關系。如圖4所示作者選擇了一組高頻突變的470個癌癥基因，然后訓練了一個彈性網絡模型來預測MIRACLE得分，作為每個樣本的突變函數，并使用隊列作為協變量。訓練模型的正系數用于識別哪些基因的突變與MIRACLE評分的增加有關，而負系數用于識別哪些基因的突變與MIRACLE評分的降低有關(圖4)。接下來作者通過十倍交叉驗證來評估模型的準確性，同時計算模型預測和真實MIRACLE評分之間的相關性。結果發現與MIRACLE呈正相關的頂級突變基因包括與癌癥亞型的差異存活率相關的基因，如IDH1等。
4. MIRACLE評分在免疫檢查點治療中的預測價值
在上述分析中，作者已經刻畫了MIRACLE對預后的影響及相關的生物學意義。接下來，在文章的最后一部分，作者為了確定MIRACLE評分在免疫檢查點治療中的臨床相關性，評估了MIRACLE評分在抗CTLA4和抗程序性細胞死亡蛋白1 (anti-PD1)治療的多個公開數據集上的預測價值。作者分析了91個抗PD1或抗PD1 及抗CTLA-4聯合治療的黑色素瘤患者。結果發現當治療前和治療中分別分析時，應答者的MIRACLE評分顯著更高。所有患者的預測AUC為0.78，而抗PD1治療子集的預測AUC達到0.81(圖5a)。接著作者研究了109例抗PD1治療前或治療中黑色素瘤患者的樣本。同樣，在所有樣本中，在治療前和治療后亞組中，應答者的MIRACLE得分顯著更高。當樣本是基于以前的檢查點治療(anti-CTLA4)的子集時，MIRACLE與檢查點治療進展樣本的反應選擇性相關(圖5b)。接下來作者利用微陣列數據對65例接受重組MAGEA3抗原免疫治療的患者的治療前黑色素瘤樣本進行了分析。結果發現MIRACLE得分在應答者中顯著更高。同時在另一組42例接受抗CTLA4治療的黑色素瘤患者的基因表達數據中發現MIRACLE評分與應答、總生存率顯著相關(圖5c)。綜上所述，可以發現與其他免疫相關特征相比，MIRACLE、ICR和TIS具有最多數據集的預測能力。
到這里這篇文章的主要內容就介紹完了，文章針對泛癌構建了一個微環境中免疫激活和免疫抑制平衡的得分特征。并對得分進行了評估以及從功能預后價值等方面進行了刻畫。可以看出文章篇幅不是很長所用到的方法也不是很復雜，但是使用數據多，選擇的研究角度也很好，在泛癌中刻畫了免疫激活及免疫抑制平衡的特征，同時也探索了功能及預后價值，免疫激活及免疫抑制聯合分析的這種研究角度值得我們學習。
