單細胞分析改進了腫瘤分類和患者分層

小伙伴們大家好，如今單細胞測序幾乎已經成了每個科研課題組的必備品了，那么拿到單細胞測序的數據后的你是否在發愁沒有好的數據分析思路呢？今天帶給大家的是一篇單細胞測序思路的文章，幫助大家好好學習~

背景知識：

免疫治療是非小細胞肺癌（NSCLC）治療的主要手段。雖然腫瘤突變負荷（TMB）與免疫治療反應相關，但對其與腫瘤基因型的關系知之甚少。本文作者使用單細胞RNA測序的方法，分析了35個早期NSCLC病變中的361929個細胞。發現了一個由PDCD1⁺CXCL13⁺激活的T細胞、IgG⁺漿細胞和SPP1⁺巨噬細胞的細胞模塊，稱為肺癌激活模塊（LCAM^hi）。作者在多個NSCLC隊列中確認了LCAM^hi的富集，并利用CITE-seq（細胞索引轉錄組和抗原決定簇測序）的方法建立了一個抗體小組來識別LCAM^hi病變。發現LCAM的存在與整體免疫細胞含量無關，但與TMB TP53突變相關。高基線LCAM評分與非小細胞肺癌患者對免疫治療的反應增強相關TMB高于中位數，表明免疫細胞成分雖然與TMB相關，但可能是免疫治療反應的非冗余生物標記物。

文章介紹：

本文¹發表在期刊: Cancer Cell，在最近一年的影響因子: 31.743比上一年增加了5.141。這篇文章展示非小細胞肺癌治療初期免疫反應的共享和可變因素，并確定腫瘤突變負擔和tp53突變的獨立免疫調節作用，以及免疫狀態如何結合來驅動免疫治療反應的精煉模型。

思路總結：

結果解讀：

目前對35例NSCLC患者匹配的腫瘤和非腫瘤組織的分析提供了迄今為止最大的早期肺癌免疫反應的scRNA圖譜。此外，CITE-SEQ分析還服務于統一細胞分類的高維模型。通過整合公共數據集和利用CITE-SEQ來設計基于抗體的互補檢測，作者展示了報告簽名在不同環境中的可用性。重要的是，基于在腫瘤病變中觀察到的高度保守的變化，這些數據支持了這樣的觀點，即盡管疾病異質性，普通免疫治療范例仍可使大部分患者受益。然而，在腫瘤中，患者可以沿著主要的LCAM軸分層。基于LCAM^hi和LCAM^lo細胞模塊的組成，作者認為LCAM^hi患者正在經歷更強烈的抗原特異性抗腫瘤適應性免疫反應。同時，無偏的LR分析顯示，不同免疫間隔的LR強度不同。雖然在人類肺癌的背景下，單個信號軸的作用仍有待機械地研究，但所描述的相互作用已知與適應性免疫激活相關，并為僅基于細胞類型頻率執行的LCAM分層提供支持。

• 腫瘤微環境中轉錄狀態

(A)研究概述。切除的腫瘤組織和肺組織被消化成單細胞懸液，富集CD45⁺細胞，并進行單細胞分析。

(B)病人的臨床資料，包括概要病理分期、吸煙史、組織學診斷和性別。

(C)細胞類型標記基因在免疫scRNA-seq簇(MNP，單核吞噬細胞；PDC，漿細胞樣樹突狀細胞)中的表達。熱圖顯示每個細胞的唯一分子標識符(UMI)的數量。使用CITE-SEQ分析的8名患者細胞的均勻抽樣顯示群集。

(D)由CITE-SEQ測量的譜系定義表面標記表達。單個單元格直接對應于(C)。首先對患者的CITE-SEQ計數值進行量化標準化，然后對熱圖中的細胞進行行歸一化。

(E)35例腫瘤和29例配對正常肺組織中免疫細胞間的聚集率。簇對應于(C)和(D)。

(F)樣本對之間的歐幾里得距離。

(G)當前隊列(x軸)或Lambrechts等人的腫瘤和非腫瘤組織中細胞類型頻率之間的對數比率。(2018)(y軸)。聚類按細胞類型注釋進行分組。

• DC3表達LCH樣簽名

(A)識別scRNA-seq樹突狀細胞簇的基因表達，顯示每個細胞的UMI數目，顯示來自四個患者的細胞，經CITE-SEQ分析，DC面板如(B)所示。

(B)直接對應于(A)項的細胞上的DC表面標記的CITE-SEQ測量。

(C)腫瘤和非腫瘤組織DC頻率的差異。

(D)LAMP3和CD274在DC簇中的平均表達。

(E)TLS中DC-LAMP⁺/PD-L1⁺DC和T細胞的MICSSS。

(F)濾泡DC標志物MYH11在TLS鄰近E區的表達。

(G)假定為單核細胞來源的MF(MOMF)、CD14⁺單核細胞、單核細胞DC、cDC2和MOMF基因信號的表達(見圖S2D和S2E)。每個分數的前20個基因在按細胞類型(左)和相應的匯總分數均勻抽樣的細胞中顯示。細胞按單核細胞：cDC2匯總分數的比率排序，并被下采樣至2000UMI。

(H)盒子圖顯示LCH-like簽名基因在DC人群中跨患者的平均表達。

• 腫瘤不包括AMF，并表現出不同的MOF群體

(A)關鍵單核細胞、MF和cDC2樣基因的平均簇表達。

(B)CITE-seq表面標記檢測。從使用所示面板分析的4例患者中，每個集群均勻采樣細胞。

(C)每種細胞類型的基因模塊評分直方圖。

(D–F)CD14 ⁺ 單核細胞、MoMF和AMF中細胞類型特異性基因評分的表達（見圖S3I）。通過AMF（x軸）和MoMF（y軸）評分繪制細胞，通過彩色點或等值線圖(D)表示細胞注釋。通過CD14 ⁺ 單核細胞評分(E)或單個基因表達(F)對細胞進行相似繪圖和著色。

(G)單核細胞和MF頻率的腫瘤和非腫瘤組織之間的差異。

(H)MNP細胞類型中編碼分泌因子的轉錄本的平均表達

• 淋巴間隔的CITE-SEQ和TCR分析

(A)識別T細胞簇的基因表達，顯示兩個患者的細胞通過CITE-SEQ與(B)所示的面板進行分析。

(B)直接與(A)中的T細胞表面標記相對應的T細胞表面標記CITE-SEQ。

(C)腫瘤與非肺組織間NK、T細胞頻率的差異。

(D和E)T細胞在組織分層克隆型中的表型分布。在有代表性的患者(D)中，scTCR-seq在肺(x軸)或腫瘤中觀察到獨特的TCR的頻率。在(E)中，首先按照(D)中定義的TCR組織特異性對細胞進行分組；對于三名患者，具有獨特TCR、組織特異性TCR或跨組織共享TCR的細胞的表型構成繪制為非腫瘤(I)和腫瘤(II)組織中具有相似組織分布的TCR的細胞百分比。每個病人都用形狀表示。

(F)區別B細胞和漿細胞簇的基因表達，顯示來自四名患者的細胞通過CITE-SEQ與(G)所示的面板進行分析。

(G)直接對應于(A)中的細胞表面標記的細胞表面標記的CITE-SEQ。

• LCAM軸分層

(A)譜系歸一化細胞類型頻率的相關性。分析包括26個處理相似的腫瘤(CD45⁺磁珠富集)。

(B)來自 Mount Sinai, Lambrechts和Zilionis等人的樣本中按譜系歸一化的LCAMhi和LCAMlo細胞型頻率。來源數據集由下面的顏色條表示。

(C)免疫譜系頻率，欄目與(B)中的患者順序相對應。

(D)測量譜系歸一化LCAM細胞類型頻率幾何平均值的分數。

(E-G)MICSSS顯示LCAM^hi病變(右側)相對LCAM^lo(E)有CD138⁺漿細胞浸潤，TLS(F)外有漿細胞浸潤，PD1⁺T細胞、CD68⁺MF和CD138漿細胞共同定位于LCAM^hi腫瘤間質(G)。

(H-M)LCAM^hi患者腫瘤與非腫瘤組織間配體受體(LR)強度的Log2比值(‘’LR比值；‘’y軸)和LCAMlo患者(x軸)。T細胞、B細胞、MF、DC3、CDC和單核細胞之間的所有相互作用，以顯著性指示(排列試驗，H)著色。虛線對角線表示結合。

(I-M)數據與(H)相同，以粗體LR比率突出顯示T細胞配體與B細胞受體(I)、T細胞配體與CDC受體(J)、MF配體與T細胞受體(K)、DC3配體與T細胞受體(L)以及CDC配體與T細胞受體(M)之間的相互作用。標有標簽的交互組件以紅色繪制。

• LCAM免疫反應相關的腫瘤特征

(A)LCAMhi和LCAMlo Bulk-RNA簽名基因在TCGA肺腺癌(LUAD)數據集中的標準化表達。顯示了與每個簽名的基因組的細胞類型關聯。根據LCAM綜合評分沿y軸對患者進行分類。

(B)整體LCAM積分(y軸)與CAF與正常成纖維細胞信號積分之差(x軸)的散點圖。

(C)LogTMB和整體LCAM得分的散點圖。患者被分為有(黑色)和沒有(紅色)吸煙相關突變特征的患者。紅線和黑線分別表示每組患者獨立計算的線性回歸關系(未檢出吸煙特征組r=0.36，p=3.3 310？4；檢出特征組r=0.36，p=1.6 3 10？12)。

• LCAM被驅動程序突變修飾，并與檢查點響應

(A和B)箱式圖相關聯，該框圖顯示TCGA LUAD患者的整體LCAM得分(A)或TMB(B)，按驅動程序突變的組合劃分。

(C和D)LogTMB上整體LCAM評分回歸的殘差直方圖，患者按TP53(C)或KRAS(D)突變狀態分層(雙側t檢驗)。

(E)LogTMB和LCAM分數散點圖，為LUAD(黑色)或LUSC(紅色)繪制。

(F)TMB與所有TCGA癌的整體LCAM評分之間的相關性，顯示Bonferroni矯正后的Spearman r(x軸)和log10(Padj)(y軸)。BRCA，乳腺浸潤性癌；STAD，胃腺癌；BLCA，尿路上皮性膀胱癌；UCEC，子宮內膜癌；COAD，結腸腺癌；胸腺，胸腺瘤；PRAD，前列腺癌；CESC，宮頸鱗癌；ACC，腎上腺皮質癌。

(G-J)TMB和整體LCAM對免疫治療反應的分層。Kaplan-Meier曲線顯示，在接受阿特唑珠單抗(antiPD-L1；G)或多西紫杉醇化療(H)的患者中，LCAM整體評分高(最高25%)與LCAM整體評分低(最低75%)的患者無進展存活(PFS)的可能性。在使用阿替唑珠單抗(左)或多西紫杉醇(I)治療的患者的分類多變量Cox比例風險分析中，顯示PFS風險比估計的LCAM和TMB狀態。Kaplan-Meier曲線顯示，在接受阿替唑珠單抗治療的TMB大于TMB中值(J)的患者中，LCAM整體評分高(最高25%)的患者發生PFS的可能性(最高25%)與LCAM整體評分低(最低75%)的患者發生PFS的可能性相比。

全文小結：

總體而言，本模型從scRNA-seq和CITE-seq定義的免疫表型中識別出一種免疫激活特征，該特征表現為腫瘤相關抗原負載和驅動器突變狀態的整合因子，與整體免疫內容無關，而與對檢查點封鎖的反應相關。因此，作者認為，與先前建議的免疫讀數相比，這個軸可以作為抗原特異性、抗腫瘤免疫激活的更直接的測量。同時，本篇文章也帶給我們更多單細胞思路的思考，感興趣的小伙伴可以關注公眾號了解更多關于單細胞的故事~

參考文獻

1. Leader AM, Grout JA, Maier BB, et al. Single-cell analysis of human non-small cell lung cancer lesions refines tumor classification and patient stratification. Cancer Cell 2021; 39(12): 1594-609 e12.