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單細胞RNA測序揭示細菌性肺炎繼發(fā)膿毒癥發(fā)病機制中的免疫細胞功能障礙
背景知識：
在膿毒癥期間，宿主對感染病原體的免疫反應失調會導致器官功能障礙。在已知的感染性病原體中，革蘭氏陰性菌是主要的致病菌，在嚴重膿毒癥患者中占62%的陽性培養(yǎng)。PBMC是評價膿毒癥患者全身免疫狀態(tài)最常用的樣本。
發(fā)現問題：
在膿毒癥期間，先天免疫細胞和獲得性免疫細胞都表現出長期功能失調的特征。
結果：
作者從2例革蘭氏陰性菌肺炎繼發(fā)膿毒癥患者中分離出PBMC，并用進行scRNA-seq檢測來探討細菌性肺炎繼發(fā)膿毒癥所致免疫細胞圖譜的動態(tài)變化。采集患者樣本，分急性期、穩(wěn)定期和恢復期三個階段。第一例急性期患者的樣本由于細胞質量低而無法進行scRNA-seq檢測，作者對來自健康對照(ID：HC-1)的PBMC進行了scRNA-seq，并結合從10×基因組學下載的另外四個來自健康對照的scRNA-seq數據集(ID：HC-2、HC-3、HC-4、HC-5)進行了比較。批次效應校正后，對所有樣品的細胞進行整合(Fig. 1A, B)。隨后，共對52,412個細胞進行了進一步分析，無監(jiān)督聚類識別出三個類(Fig. 1B)。 這三個簇都是由每個樣本的細胞組成的，這表明批次效應得到了很好的校正(Fig. 1C)。根據典型細胞標記基因，將其進一步標注為T/NK細胞(CD3D+ IL32+ NKG7+)、髓系細胞(CD14+ FCGR3A+ S100A9+)和B細胞(CD79B+ CD79A+ IGHM+)(Fig. 1D, E)。接下來，作者計數了每個疾病階段和健康對照組的免疫細胞組成，以揭示疾病進展過程中的實質性變化。細菌性肺炎繼發(fā)膿毒癥患者T/NK細胞和B細胞減少，髓系細胞擴張。與正常對照組比較，細菌性肺炎繼發(fā)膿毒癥患者T/NK細胞和B細胞減少(Fig. 1F)。在疾病過程中發(fā)生了意想不到的變化。T/NK細胞比例持續(xù)下降，髓系細胞比例持續(xù)升高，恢復期尤為明顯(圖1F)，提示恢復期仍存在免疫細胞紊亂。
為了進一步剖析肺炎繼發(fā)膿毒癥發(fā)病的分子機制，作者對各個疾病階段和健康對照組之間的所有差異表達基因進行了通路富集分析，以期找到疾病狀態(tài)下發(fā)生變化的信號通路(Fig. 2A, B, C)。與健康對照組相比，所有三個階段的患者都表現出干擾素γ反應上調。與穩(wěn)定期相比，恢復期的患者也表現出干擾素γ反應和干擾素α反應的上調。此外，干擾素應答基因包括IFNGR1、IFITM2、IFITM3、IFI6、ISG15和ISG20在疾病進展過程中呈增加的現象(Fig. 2D)。提示干擾素反應在疾病過程中的可能起到持續(xù)性作用。與健康對照組相比，急性期和恢復期通過NFκB的TNFA信號也上調(Fig. 2A, C)。恢復期患者與穩(wěn)定期患者相比，NF-κB信號轉導上調，而與健康對照相比，NFκBIA、JUNB、TNFAIP3、CCL4和SOCS3等參與該通路的基因在疾病分期中高表達(Fig. 2D)。作者接下來為了探索病程和健康對照組之間的這些途徑改變是否由某些細胞亞型驅動，進一步擴展了所有免疫細胞亞群中的通路富集分析。結果顯示，干擾素γ反應在T/NK細胞的所有疾病階段都上調(Fig. 2E)。這提示T/NK細胞在疾病進展過程中可能參與干擾素γ反應的上調。在與健康對照組相比中，髓系細胞急性期和恢復期的TNFA通過NFκB信號通路上調(Fig. 2F)。提示髓系細胞可能與病期NF-κB上調TNFA信號有關。與急性期相比，NF-κB介導的TNFA信號在穩(wěn)定期下調，而在恢復期與穩(wěn)定期相比上調，提示穩(wěn)定期炎癥消退，但在恢復期，炎癥卻聚集。然而，在B細胞中，mTORC1信號在所有疾病階段都上調，在恢復期比穩(wěn)定期下調。這一信號僅在急性期與健康對照相比上調(Fig. 2A)。這提示肺炎繼發(fā)膿毒癥中信號通路的整體改變可能與T/NK細胞和髓系細胞有關。接下來，作者探討了疾病進展過程中基因表達的動態(tài)轉錄變化。發(fā)現了8個具有不同時間依賴表達模式的簇，并對這些簇中的基因的生物學功能進行了評估(Fig. 2G)。Cluster1由2989個基因組成，這些基因在病程過程中表達下降。簇1中基因的功能主要為自噬功能(Fig. 2G)。以往的研究表明，膿毒癥時由于自噬的修復導致近端腎小管功能障礙，提示Cluster1基因的動態(tài)表達可能與膿毒癥腎臟損傷有關。簇6包含2283個在疾病階段持續(xù)增加表達的基因。這些基因對I型干擾素的產生具有調控作用(Fig. 2G)。并且與干擾素反應基因在疾病階段的表達上調是一致的(Fig. 2D)。
由于T細胞和NK細胞是健康對照組的主要細胞群，且在細菌性肺炎繼發(fā)膿毒癥的過程中呈持續(xù)下降趨勢，其在不同疾病階段的組成和分子變化可能反映疾病進展的嚴重程度。因此，作者接下來對T/NK細胞進行了重新聚類，更精細分析它們的動態(tài)變化。生成了10個簇，并通過UMAP圖進行了可視化(Fig. 3A)。根據細胞標志基因將CD4+T、CD8+T相關亞型分類 (Fig. 3B)。為了進一步了解每個亞型的功能，作者進行了基因本體論(GO)分析。CD8+Tem細胞、Treg細胞、PRO-T細胞、CD8+Te細胞和NK細胞參與干擾素-γ的應答(Fig. 3C)。此外，干擾素-γ反應基因包括干擾素受體(IFNGR1)、ISG15、IFI44L、IFI6和IFITM3的表達模式不同，幾乎所有T和NK細胞亞型在病程中的表達水平均高于健康對照組。所有亞型都有豐富的淋巴細胞活化(Fig. 3C)。同時，T細胞活化的標志物CD69+在疾病狀態(tài)下也比健康對照組高表達，提示T細胞和NK細胞的免疫應答被激活(Fig. 3D)。而CD4+TPM細胞、NKT細胞、CD4+、CD28+T細胞、CD8+Te細胞和NK細胞參與了凋亡過程的正向調控，提示T細胞處于免疫抑制狀態(tài)(Fig. 3C)。膿毒癥的免疫抑制主要表現為淋巴細胞，尤其是T細胞的凋亡和耗竭。進一步檢測促凋亡相關基因，如TNFSF10、TNFRSF1B、BCL2L11和CASP3等基因的表達，發(fā)現包括PRDM1和LAG3在內的T細胞耗竭相關標志物在所有T和NK細胞亞型(CD4+CD28+T細胞除外)的疾病進展過程中均上調(Fig. 3D)。接下來，作者研究了細菌性肺炎繼發(fā)膿毒癥進展過程中T和NK細胞亞群的免疫學變化。從細胞組成的角度來看，T細胞和NK細胞在疾病狀況和健康對照組之間呈現出不同的表達。膿毒癥患者CD4+TN細胞和CD8+TN細胞明顯減少，提示這些細胞亞群處于免疫抑制狀態(tài)。這兩種細胞在病情發(fā)展過程中均表現出相似的下降趨勢，急性期開始下降，穩(wěn)定期略有增加，恢復期進一步下降(Fig. 3E)。CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞的比例在病程中呈上升趨勢，這與CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞在淋巴細胞活化中的作用一致，提示它們的免疫效應增強。CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞隨病期升高趨勢相似，急性期升高，穩(wěn)定期略有下降，恢復期持續(xù)升高(Fig. 3E)。此外，與健康對照組相比，NK細胞在疾病過程中的比例增加。健康對照組和急性期的NK細胞比例相當，但在隨后的兩個疾病階段，NK細胞比例逐漸升高(Fig. 3E) 為了進一步探討NK細胞的細胞和功能變化。作者再次進行了重新群集，并將NK細胞分為兩個群集：NK1和NK2(Fig. 3F)。NK1高表達FGFBP2、GZMB和FCGR3A，參與細菌、吞噬和I-kappaB激酶/NF-kappaB信號轉導（Fig. 3G)。NK2高表達GZMK、XCL1和KLRC1，參與淋巴細胞活化、細胞因子介導的信號通路和細胞殺傷（Fig. 3G) 細胞成分分析揭示了NK細胞亞群的動態(tài)變化。NK細胞亞群以NK1為主。NK1在急性期和穩(wěn)定期升高，然后下降到與正常對照組相似的水平，而NK2則呈現相反的趨勢，表明恢復期患者NK細胞的細胞比例有所恢復(Fig. 3H)。然而，即使在恢復期，NK細胞在疾病階段仍表達高水平的耗竭和凋亡標記基因，這表明盡管恢復了細胞組成，但恢復期患者的NK細胞功能仍然存在(Fig. 3D)。
在作者的數據中，髓系細胞是不同疾病階段的主要改變細胞群，表明對膿毒癥有強烈的免疫學反應。然后，作者對總的髓系細胞進行了重新分類，以進一步探討細菌性肺炎繼發(fā)的膿毒癥引起的動態(tài)轉錄改變。隨后，獲得了8個聚類，并利用UMAP圖進行了直觀的分析(Fig. 4A)。根據細胞標記將其分為6種單核細胞亞型(CD14+/FCGR3A+)、巨核細胞(MK, PF4+PPBP+)、樹突狀細胞(DC, JCHAIN+SEC11C+) (Fig. 4B)。這些細胞亞群的功能特征是不同的，GO分析揭示了這些細胞亞群的功能特征。幾乎所有的細胞亞型都參與調節(jié)細胞因子的產生和對細菌的應答，表明單核細胞處于激活的免疫狀態(tài)(Fig. 4C)。CD14+MonO2、CD16+Mono、CD24+Mono、HLA-DR+Mono和LDHB+Mono參與淋巴細胞活化(Fig. 4C) 而CD14+Mono2和CD16+Mono在正向調節(jié)細胞死亡、凋亡信號通路、負向調節(jié)細胞增殖和負向調節(jié)免疫系統(tǒng)過程中富集顯著(Fig. 4C)。提示髓系細胞特別是單核細胞可能參與了淋巴細胞活化和凋亡的調節(jié)。由于與健康對照組相比，髓系細胞在三個疾病階段表現出持續(xù)增加的趨勢，作者接下來以更細致分析這種表型是否存在。因此，作者對疾病進展過程中的成分變化有了更深入的了解。出乎意料的是，急性期和穩(wěn)定期的髓系細胞亞型比例與健康對照組相當。一種新發(fā)現的單核細胞類型CD24+Mono是在恢復期特異性地出現的，它在調節(jié)胞吐、對細菌的反應和對其他生物的防御反應中發(fā)揮作用(Fig. 4C, D)。然而，這種新的細胞類型主要來源于第一例患者，這表明膿毒癥患者個體之間的特性是不同的。髓系細胞的功能改變主要集中在恢復期，疾病期與健康人之間的差異表達基因集中在恢復期，尤其是恢復期的髓系細胞功能主要表現為髓系白細胞活化、細胞因子產生的正調節(jié)、巨噬細胞和對細菌起源分子的應答(Fig. 4E)。提示在恢復期患者中，髓系
細胞參與的激活免疫反應仍然存在。
細菌性肺炎繼發(fā)膿毒癥時B細胞耗盡。然而，在不同的疾病階段中，它們的比例沒有明顯的變化。這促使作者以更精細的方式探索細胞和分子的變化。因此，使用UMAP將B細胞重新聚為三個簇并直觀的展示(Fig. 5A)。第0簇表達高水平的TCL1A、IGHD和IL4R，參與免疫效應過程、B細胞增殖和淋巴細胞的調節(jié)，被定義為B幼稚細胞(B naive cells，Bn)。(Fig. 5B, C) 與B細胞分化相關的簇1高表達AIM2、TNFRSF13B和CD27被鑒定為B記憶細胞(BM) (Fig. 5B, C)。簇2由于MZB1、IGHG3和JCHAIN的高表達被注釋為漿細胞(Fig. 5B) 此外，漿細胞還具有豐富的多種功能，包括抗原處理和提呈、信號肽處理、抗原處理和通過MHC I類分子提呈多肽抗原以及參與白細胞活化(Fig. 5C)。根據漿細胞所具有的多種功能，在疾病的不同階段，漿細胞所占比例均高于健康對照組，穩(wěn)定期達高峰，恢復期相對下降(Fig. 5D)。接下來，作者試圖研究急性期和穩(wěn)定期漿細胞增殖的潛在機制。作者試圖探索NK細胞和漿細胞之間潛在的調控網絡，以剖析NK細胞對漿細胞增殖的影響。在急性期和穩(wěn)定期，IFNG和HLA-DRA顯示了豐富的配體和靶基因的調節(jié)潛力。并且與健康對照組相比，HLA-DRA在三個疾病階段的表達水平的變化規(guī)律與漿細胞比例的變化規(guī)律相似(Fig. 5E)。這提示HLA-DRA表達的變化與漿細胞的增殖是平行的。為探討IFNG對HLA-DRA的調控機制，推測了IFNG與HLA-DRA之間潛在的信號轉導途徑，IFNG可能通過EP300、STAT1、SPI1和RFX5等途徑調控HLA-DRA (Fig. 5F) 。提示NK細胞與漿細胞的潛在細胞間相互作用通過IFNG信號通路對漿細胞的增殖起著至關重要的作用。
T細胞既有免疫激活狀態(tài)，又有免疫抑制狀態(tài)，作者觀察到不同的單核細胞亞群調節(jié)淋巴細胞活化，并參與細胞凋亡途徑。此外，研究還表明膿毒癥患者的T細胞功能以單核細胞依賴的方式受到抑制。作者的下一個目標是探索單核細胞和T細胞之間是否存在細胞內相互作用。因此，作者構建了單核細胞與不同疾病階段T細胞之間可能的細胞相互作用網絡，以研究單核細胞是否影響T細胞的激活和抑制。作者為了探討單核細胞在T細胞活化中的作用，選擇了CD14+Mono2、CD16+Mono、CD24+Mono、HLA-DR+Mono和LDHB+Mono等單核細胞亞群作為sender cells，因為它們與淋巴細胞激活高度相關。 CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞被選為receiver cells，因為CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞在疾病各個階段的比例比健康對照組持續(xù)增加。根據CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞在疾病誘導時的差異表達基因，NicheNet被用來預測選定的單核細胞與T細胞之間的相互作用。在CD8+Te細胞中，配體與相應受體的相互作用集中在恢復期，而在急性期則很少(Fig. 6A)。同時，在恢復期，選定的單核細胞與CD8+Tem細胞之間的配體-靶標相互作用也很豐富(Fig. 6B)。因此，作者主要集中在恢復期配體介導的細胞內相互作用。有趣的是，在預測的配體中，作者發(fā)現IL1B在CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞的調節(jié)中由選定的單核細胞表達此外，S100A9、Jun和S100A8是受IL1B潛在調控的CD8+Te細胞和CD8+Tem細胞的共同靶基因(Fig. 6A, B)。進一步分析IL1B與其靶基因之間潛在的信號轉導途徑，發(fā)現了一些轉錄調控因子，包括SPL1、relA、FOS、EP300、STAT3、IRAK1和MYC(Fig. 6C) 對于CD4+TN細胞，配體-靶點的相互作用集中在急性期和穩(wěn)定期，但在恢復期不能預測，因為在恢復期和健康對照組之間沒有發(fā)現差異表達的基因(Fig. 6D)。對CD8+TN細胞的進一步分析表明，配體-靶點相互作用在疾病的各個階段都有所富集，提示所選的單核細胞可能在疾病進展過程中對CD8+TN細胞發(fā)揮其調節(jié)功能(Fig. 6E)。特別有趣的是，PRDM1被發(fā)現在不同疾病階段的T細胞亞型中表達上調，支持單核細胞可能促進以PRDM1為靶點的CD4+TN細胞和CD8+TN細胞的耗竭。此外，還觀察到一些轉錄調控因子如SPL1、IRAK1、STAT3、RELA、SMAD3和PRTN3與IL1B-PRDM1信號通路有關(Fig. 6F)。
干擾素應答相關基因IFITM2、IFITM3、ISG20和ISG15在三種膿毒癥病因中均有高表達，其中IFITM2和IFITM3在三種膿毒癥病因中的表達變化與它們之間干擾素γ應答的變化是一致的(Fig. 7A)。所有的細胞亞群在已下載的scRNA-seq數據集中進行了注釋(Fig. 7B, C)。SARS-COV-2誘導的膿毒癥和流感病毒誘導的膿毒癥T/NK細胞比例均低于細菌性膿毒癥(Fig. 7B)。然而，無論是SARS-COV-2誘導的膿毒癥還是流感病毒誘導的膿毒癥，與細菌性膿毒癥相比，髓系細胞和B細胞的比例都更高(Fig. 7C)。有趣的是，當比較膿毒癥的三種病因時，通路富集分析顯示上述細胞亞型的干擾素γ反應上調。與細菌性膿毒癥相比，SARS-COV-2誘導的膿毒癥患者CD14+Mono1、NK1細胞、CD4+TPM細胞、CD8+Tem細胞、CD8+Te細胞、BM細胞和Bn細胞的干擾素γ應答上調(Fig. 7D)。因此，作者研究了細菌性膿毒癥、SARS-COV-2誘導的膿毒癥和流感病毒誘導的膿毒癥的T細胞的耗竭和凋亡特征是否存在差異。令人驚訝的是，SARS-COV-2誘導的膿毒癥的耗竭和凋亡水平最高，其次是流感病毒誘導的膿毒癥，最后是細菌性膿毒癥，反映在PRDM1，CASP1，TNFSF10和TNFRSF1B的表達上(Fig. 7E)。
本研究探討了革蘭氏陰性菌肺炎繼發(fā)膿毒癥時循環(huán)免疫細胞在單細胞分辨率上的動態(tài)變化，為疾病進展過程中潛在的免疫應答機制提供了初步的研究結果。
