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大家好呀，今天分享的文章題為通過綜合分析bulk和scRNA-seq數(shù)據(jù)識(shí)別和驗(yàn)證一種預(yù)測(cè)肺腺癌預(yù)后和免疫治療的肌肉衰竭指數(shù)，于今年一月發(fā)表在《Frontiers in Immunology》（IF = 8.786）上，文章有許多創(chuàng)新之處，讓我們一起學(xué)習(xí)一下吧！
一、背景與摘要
肺腺癌（lung adenocarcinoma（LUAD））患者的運(yùn)動(dòng)因子的產(chǎn)生與運(yùn)動(dòng)的有益作用呈正相關(guān)。骨骼肌響應(yīng)急性和慢性運(yùn)動(dòng)時(shí)釋放運(yùn)動(dòng)因子，這些運(yùn)動(dòng)衍生分子通過內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌途徑參與多系統(tǒng)調(diào)節(jié)反饋，如葡萄糖維穩(wěn)、肌肉功能和抗炎反應(yīng)等。然而，我們對(duì)運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的基因、運(yùn)動(dòng)因子、腫瘤微環(huán)境與腫瘤預(yù)后之間的關(guān)系知之甚少。根據(jù)前人的研究結(jié)果，有四個(gè)基因（BDNF、FNDC5、IL15、MSTN）作為與體育鍛煉和骨骼肌密切相關(guān)的基因，被發(fā)現(xiàn)直接或間接影響腫瘤的發(fā)生和預(yù)后，我們的研究主要集中在這四個(gè)基因上。
本研究提出了一種基于肌肉衰竭相關(guān)基因的新評(píng)分系統(tǒng)。首先，作者對(duì)數(shù)據(jù)集GSE131907進(jìn)行單細(xì)胞分析，鑒定出了8個(gè)細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中4個(gè)肌肉衰竭相關(guān)基因顯著增加。其中IL15廣泛分布于免疫細(xì)胞群中。使用LASSO算法創(chuàng)建了基于10個(gè)肌肉衰竭相關(guān)基因的肌肉衰竭指數(shù)（Muscle failure index（MFI））模型，MFI是總生存期（OS）的獨(dú)立預(yù)后因素。在單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中計(jì)算MFI，其中高M(jìn)FI的細(xì)胞比低MFI的細(xì)胞接收和發(fā)送更多的信號(hào)。兩種亞型的生物學(xué)功能分析顯示，低MFI組具有較強(qiáng)的抗腫瘤免疫活性，而高M(jìn)FI組的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的代謝和增殖活性。最后，作者系統(tǒng)地評(píng)估了LUAD患者的免疫細(xì)胞活性和免疫治療反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)低MFI組對(duì)免疫治療更為敏感。
二、數(shù)據(jù)介紹
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：GSE131907，共挑選了29個(gè)樣本（包含正常肺組織、早期、晚期和腦轉(zhuǎn)移癌病例）；
TCGA-LUAD患者的轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)、Mutect2突變數(shù)據(jù)、Humanmethylation450陣列、拷貝數(shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床資料共492個(gè)樣本。原始FPKM測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)TPM歸一化后作為訓(xùn)練隊(duì)列。
從GEO中收集了三個(gè)成熟的LUAD隊(duì)列：GSE30219（Affymetrix HG-U133 Plus 2.0）；GSE72094（Rosetta/Merck Human RSTA Custom Affymetrix 2.0），GSE72094（Illumina HumanWG-6 V3.0 Expression Beadchip）。使用SVA包去除批次效應(yīng)后共使用615個(gè)具有完整臨床信息的LUAD數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證隊(duì)列。
具有完整臨床信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的免疫治療隊(duì)列：298名接受抗PD-L1免疫治療的晚期尿路上皮癌患者的隊(duì)列（Imvigor210），以及27名接受PD1治療的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的隊(duì)列（GSE1352222）。
三、結(jié)果
1、LUAD中肌因子基因表達(dá)譜的鑒定
本研究主要集中在4個(gè)肌因子/運(yùn)動(dòng)因子基因（BDNF、FNDC5、IL15、MSTN），在TCGA-LUAD訓(xùn)練集顯示這4個(gè)基因在腫瘤組織和正常組織中顯著差異表達(dá)，F(xiàn)NDC5在腫瘤組表達(dá)下調(diào)，而BDNF、IL15和MSTN在腫瘤中表達(dá)上調(diào)。作者分析了4個(gè)肌因子/運(yùn)動(dòng)因子基因的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)BDNF與其它3個(gè)基因沒有顯著相關(guān)，而IL15與FNDC5呈負(fù)相關(guān)，與MSTN呈正相關(guān)；MSTN和FNDC5呈正相關(guān)。隨后，發(fā)現(xiàn)IL15和MSTN是LUAD患者OS的有利因素，而FNDC是LUAD患者OS的不利因素。BDNF對(duì)生存率沒有顯著影響。對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集分析注釋共鑒定了8個(gè)細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因在腫瘤細(xì)胞中明顯增加，而且IL15在免疫細(xì)胞群中廣泛分布（圖1）。
2、4個(gè)肌因子/運(yùn)動(dòng)因子基因的表達(dá)與LUAD患者的不良預(yù)后和免疫逃逸相關(guān)
作者分析四個(gè)基因mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、ki67陽(yáng)性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因的高表達(dá)與LUAD患者的腫瘤進(jìn)展相關(guān)。接下來，對(duì)4個(gè)基因的表達(dá)和患者的生存期進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IL15和MSTN高表達(dá)、FNDC5低表達(dá)的患者生存期較長(zhǎng)，而BDNF對(duì)生存期無顯著影響。通過免疫熒光檢測(cè)了腫瘤組織中PD1和CTLA4的染色強(qiáng)度，并分析了4個(gè)基因的mRNA水平與PD1和CTLA4染色熒光強(qiáng)度的相關(guān)性。結(jié)果顯示，BDNF、IL15、MSTN的高表達(dá)與PD1和CTLA4的高熒光強(qiáng)度相對(duì)應(yīng)，而FNDC5的表達(dá)與PD1和CTLA4的熒光強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（圖2）。
3、肌肉衰竭指數(shù)（MFI）模型的構(gòu)建與驗(yàn)證
相關(guān)性分析確定與4個(gè)基因顯著相關(guān)的共884個(gè)肌肉衰竭相關(guān)基因。cox回歸分析確定了56個(gè)具有顯著預(yù)后療效的肌肉衰竭相關(guān)基因，利用這56個(gè)基因構(gòu)建模型。在所有組合中，發(fā)現(xiàn)10個(gè)基因的模型是最穩(wěn)定的，使用MFI來區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者，生存分析顯示，高危組患者的生存率低于低危組。該模型在1年、3年和5年時(shí)的AUC值分別為0.743、0.716和0.67（圖3）。
4、評(píng)估MFI的預(yù)測(cè)獨(dú)立性
首先采用單因素Cox和多因素Cox回歸方法分析了癌癥患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、臨床特征與預(yù)后之間的關(guān)系。兩種分析結(jié)果都顯示MFI是OS的獨(dú)立預(yù)后因素。通過列線圖量化LUAD患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示，列線圖模型在1年、3年和5年時(shí)具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。tROC分析表明，與臨床特征相比，列線圖模型是最好的預(yù)測(cè)方式。然后作者進(jìn)一步進(jìn)行了決策曲線分析（Decision curve analysis（DCA））來評(píng)估列線圖模型的決策效益，結(jié)果表明列線圖適用于LUAD患者在1年、3年和5年的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（圖4）。
5、單細(xì)胞數(shù)據(jù)中MFI評(píng)分
作者對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)計(jì)算MFI評(píng)分，結(jié)果顯示MFI主要分配在特定的惡性細(xì)胞組和大多數(shù)免疫細(xì)胞中。根據(jù)MFI將惡性細(xì)胞分為高M(jìn)FI組和低MFI組。通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)，高M(jìn)FI組的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞互作最多。最后對(duì)細(xì)胞間通信的特定通路分析，發(fā)現(xiàn)與低MFI組相比，高M(jìn)FI細(xì)胞在GDF、VEGF、SEMA3和UGRP1通路中表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性，高M(jìn)FI細(xì)胞可能在癌癥增殖、代謝和血管生成中更為活躍。（圖5）
6、兩種亞型生物學(xué)功能的差異
通過對(duì)高低MFI兩組進(jìn)行差異基因的分析，得到806個(gè)基因，其中607個(gè)在高M(jìn)FI組上調(diào)，199個(gè)在低MFI組上調(diào)。功能富集分析顯示，高M(jìn)FI組上調(diào)的基因主要調(diào)控細(xì)胞周期和Gap連鎖通路，而低MFI組上調(diào)的基因主要調(diào)控造血細(xì)胞譜系、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附、B細(xì)胞受體、T細(xì)胞受體和淋巴細(xì)胞遷移。這些結(jié)果證實(shí)了低MFI組具有較強(qiáng)的抗腫瘤免疫活性，而高M(jìn)FI組的腫瘤細(xì)胞往往具有較強(qiáng)的代謝和增殖活性，這可能是導(dǎo)致兩組間預(yù)后差異的原因之一（圖6）。
7、評(píng)估了MFI與免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性
首先，作者從免疫活性方面評(píng)估了MFI，結(jié)果顯示，高M(jìn)FI組的髓系免疫、PD-L1和IDO1均顯著升高，并與MFI呈正相關(guān)。相反，除MHC I類和癌旁免疫外，所有免疫通路活性均顯著升高，幾乎所有免疫檢查點(diǎn)均與MFI呈負(fù)相關(guān)，并在低MFI組中增強(qiáng)。從免疫浸潤(rùn)的角度評(píng)估MFI發(fā)現(xiàn)高M(jìn)FI組腫瘤純度增加，而低MFI組基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞增加。最后，作者分析了與腫瘤特異性抗原相關(guān)的4個(gè)指標(biāo)，結(jié)果顯示，MFI與HRD評(píng)分、Indel新抗原與SNV新抗原呈負(fù)相關(guān)，然而腫瘤內(nèi)異質(zhì)性與MFI無顯著相關(guān)性，提示低MFI組具有更嚴(yán)重的染色體不穩(wěn)定、更多的腫瘤新抗原和更強(qiáng)的免疫活性，提示該組更有可能從免疫治療中獲益（圖7）。
8、MFI與基因組變異的相關(guān)性
研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤突變負(fù)荷（TMB）與免疫治療反應(yīng)有關(guān)，這可能是由于體細(xì)胞突變產(chǎn)生的突變來源的抗原增加所致。當(dāng)免疫系統(tǒng)識(shí)別出那些含有突變多肽的抗原時(shí)，抗腫瘤免疫就會(huì)被激活。考慮到TMB的關(guān)鍵作用，本文探討了TMB和MFI之間的相關(guān)性。作者總結(jié)了高M(jìn)FI組和低MFI組的突變特征，發(fā)現(xiàn)MFI與TMB呈負(fù)相關(guān)，而低MFI組的TMB顯著升高。森林圖顯示了低MFI組中存在突變頻率較高的驅(qū)動(dòng)突變基因。評(píng)估CNV和MFI之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，低MFI組在染色體臂水平上的擴(kuò)增和缺失頻率增加（圖8）。
9、低MFI組對(duì)免疫治療更為敏感
IPS可以系統(tǒng)地評(píng)估癌癥患者的效應(yīng)免疫細(xì)胞活性和免疫治療反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在TCGA和GEO的隊(duì)列中，低MFI組的IPS顯著升高。同時(shí)，TIDE算法預(yù)測(cè)MFI水平較低的患者可能對(duì)免疫治療有更高的應(yīng)答率。ROC分析顯示MFI比常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)更具有優(yōu)勢(shì)。低MFI組的患者對(duì)抗pd1/CTLA-4治療治療更為敏感。在一個(gè)成熟的免疫治療隊(duì)列中構(gòu)建了MFI，結(jié)果顯示在高危組中MFI的生存率明顯更差。然后作者評(píng)估了免疫治療隊(duì)列中TMB、新抗原和MFI之間的關(guān)系，觀察到MFI與TMB和新抗原數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，低風(fēng)險(xiǎn)組中TMB和新抗原數(shù)量顯著較高，這可能導(dǎo)致PD-L1免疫治療的更好結(jié)果。總之，確定了低MFI組對(duì)免疫治療更為敏感（圖9）。
四、小結(jié)
本文通過對(duì)bulk和scRNA-seq數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析，根據(jù)以往的研究報(bào)道肺腺癌（LUAD）患者的運(yùn)動(dòng)因子的產(chǎn)生與運(yùn)動(dòng)的有益作用呈正相關(guān)，構(gòu)建出了和LUAD預(yù)后相關(guān)的肌肉衰竭指數(shù)（MFI）。作者通過篩選和運(yùn)動(dòng)因子相關(guān)的基因構(gòu)建模型并研究MFI指數(shù)和不同指標(biāo)以及生存預(yù)后之間的關(guān)系。本文的亮點(diǎn)在于作者開發(fā)了預(yù)測(cè)患者生存的MFI評(píng)分指數(shù)模型，并通過數(shù)據(jù)證明了MFI與生存指數(shù)相關(guān)。接下來作者通過MFI將患者分成了高低兩組，比較兩組之間功能差異和細(xì)胞浸潤(rùn)比例差異并發(fā)現(xiàn)低MFI組對(duì)免疫治療更為敏感，這對(duì)LUAD精準(zhǔn)個(gè)性化治療提供了新的思路。最后通過對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充，發(fā)現(xiàn)了MFI模型相關(guān)基因廣泛分布于免疫相關(guān)細(xì)胞群中，而在惡性細(xì)胞中表達(dá)較少。
參考文獻(xiàn)：Gu X, Cai L, Luo Z, Shi L, Peng Z, Sun Y, Chen J. Identification and validation of a muscle failure index to predict prognosis and immunotherapy in lung adenocarcinoma through integrated analysis of bulk and single-cell RNA sequencing data. Front Immunol. 2023 Jan 17;13:1057088. doi: 10.3389/fimmu.2022.1057088 . PMID: 36733390 ; PMCID: PMC9888242 .
