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大家好呀，今天分享的文章題為腹水液的單細胞測序顯示了胃癌腹膜轉移期間的異質性和治療誘導的進化，于今年二月發表在Nature communication（IF: 17.694），本文通過在單細胞水平上分析不同組別的胃癌患者腹水液探索胃癌腹膜轉移的發病機制，讓我們一起學習一下吧！
Single-cell sequencing of ascites fluid illustrates heterogeneity and therapy-induced evolution during gastric cancer peritoneal metastasis
一、背景
胃癌（Gastric cancer , GC）是全球第五大診斷癌癥和第四大癌癥的死亡原因。胃癌腹膜轉移（gastric cancer peritoneal metastasis , GCPM）是治療性手術切除后常見的疾病，總生存期小于6個月。在手術期診斷為GCPM的胃癌患者從抗腫瘤治療策略中獲得的益處有限且GCPM發生發展的分子機制尚不清晰。因此，深入、動態地探索GCPM的發生和發展，有助于闡明GCPM的發病機制。本文通過分析不同GC單細胞數據探索GCPM的發病機制。
二、結果
1、胃癌患者的腹水或腹膜灌洗液中細胞生態系統的動態變化
本文對35例患者進行單細胞測序，包括4例良性子宮肌瘤患者（正常陰性對照，G0組）正常腹腔灌洗液，4例早期胃癌患者(G1組）腹腔灌洗液；10例晚期胃癌患者(G2組）腹腔灌洗液；12例未治療診斷GCPM的晚期胃癌患者(G3組）腹水；5例全身治療后確診GCPM的晚期胃癌患者腹水(G4組）腹水（圖1a）。另外收集了4例未確診為GCPM的晚期胃癌患者的腹水樣本，培養腹水PDOs進行基于抑制劑藥物干預實驗和免疫熒光分析進行實驗驗證（圖1b）。對來自五組單細胞數據進行嚴格的質量控制、細胞過濾和去批次得到191987個細胞，鑒定出12個細胞簇（圖1c）。基于單細胞數據進行拷貝數變異的分析，結果顯示所有被鑒定出的上皮細胞均被證實為惡性腫瘤細胞。在GCPM進展過程中， 12個細胞簇表現出不同的分布，巨噬細胞/單核細胞和T細胞是腹腔內的主要細胞組成，分別呈減少和增加的趨勢（圖1d-e）。
2、單核細胞樣樹突狀細胞在GCPM期間表現出較高的多樣性和促血管生成表型
作者首先分析了G0-G3組，以探索GCPM過程中免疫細胞景觀和免疫細胞的動態變化。髓系細胞主導著免疫細胞群，cDC2亞群在不同組間存在明顯差異，隨著胃癌的進展，這些細胞浸潤到腹腔內的數量減少，特別是GCPM患者。為了探索細胞簇潛在獨特功能作用，作者又將髓系重新劃分為4個DC簇，3個巨噬細胞簇，2個單核細胞簇，1個中性粒細胞簇和1個肥大細胞簇（圖1f）。C3-DC是一個cDC2簇，具有較低的抗原-呈遞能力和較高的促血管生成能力，它似乎在很大程度上代表增殖的DC (圖1f-g)。
采用功能評分來探討GCPM過程中每種DC類型的功能變化，C1-DC和C4-DC簇在樹突狀細胞中抗原提呈能力最高，G3組抗原提呈能力無明顯變化，而C2-DC和C3-DC-簇（單核樣樹突狀細胞）在G3組抗原提呈功能評分和功能分子表達明顯降低。在G3組GCPM過程中，C2-DC和C3-DC簇顯示促血管生成功能評分和功能分子表達增加（圖2a-b）。對四個DC簇進行擬時序分析，C1-DC和C4-DC簇位于起源，C2-DC簇位于中間，C3-DC簇抗原呈遞能力較低，在擬時序的末端，促血管生成能力較高（圖2c）。因此作者檢測了樹突狀細胞的代謝重編程，觀察到糖酵解和脂肪酸代謝沿單核細胞樣表型逐漸增加，而氧化磷酸化在早期和中期增加，在分化后期略有下降（圖2d）。擬時序熱圖發現C3-DC上調mTORC1激活和E2F信號通路相關基因，同時增強糖酵解、脂肪酸代謝、氧化磷酸化和膽固醇代謝；一些免疫檢查點基因沿DC分化軌跡逐漸上調，特別是在晚期，表明C3-CDC可能抑制腫瘤免疫（圖2e-f）。并驗證了C3-DC簇基因特征與預后顯著相關，使其成為GCPM不良臨床結果的潛在指標。
3、T細胞抑制狀態在GCPM進展中有不同的重構
T細胞在腫瘤免疫中起關鍵作用，本文又將T和NK細胞重新劃分（圖3a-b）。在腹膜生態系統中觀察到一個以MKI67、MCM2和PCNA高表達為特征的增殖循環T細胞簇（圖3a-c）。這些細胞表現出細胞毒性和幼稚細胞基因的低表達，以及抑制標志物的高表達（圖3d）。與G0-G2組相比，G3組的細胞毒性功能評分及相應的標記基因GZMA和GZMH均降低。因此，增殖循環T細胞簇可能表現出一種功能失調的狀態，并類似于一種幼稚的表型，GSEA分析表明，循環T細胞簇在參與細胞周期、糖酵解和DNA復制的基因中富集，可能準備增殖所需的材料和能量，并在細胞毒性基因中負富集。
作者研究了增殖周期T細胞簇的組成，發現它由兩個CD8細胞簇（C1、C2循環T）和一個NKT細胞簇（C3循環T）的異質細胞簇組成（圖3e）。與G1組和G2組相比，G3組的C2循環T細胞簇比例增加（圖3f）。通過分化循環T細胞軌跡，發現軌跡始于C6-CD8幼稚簇，通過C4-CD8和C1循環T細胞簇，最終形成C2循環T細胞簇（圖3g-h）。代謝轉變對于CD8 T細胞的存活、增殖、分化和抗腫瘤免疫中的激活至關重要。觀察到糖酵解、脂肪酸代謝和NAD代謝隨著發育軌跡的變化而明顯上調（圖3g，i），增殖型C2循環T細胞高表達增殖基因，獲得部分幼稚功能，導致細胞毒性功能降低，抑制功能增強（圖3h，j）。因此C2循環T細胞簇可能代表了一個耗盡和功能失調的階段。
4、治療誘導的單核細胞樣DC和循環T細胞免疫表型的進化
腫瘤生態系統中的細胞在治療前后表現出很強的異質性，觀察到治療后C2-DC簇減少（圖4a），治療導致C3-DC細胞（早期顯示為GC的晚期群體）獲得增殖和促血管生成能力，其抗原的呈遞能力顯著降低（圖4b）。C3-DC細胞顯著上調炎癥因子CCL2、CCL3和CCL4，可能招募炎癥單核細胞、單核細胞樣、中性粒細胞和巨噬細胞進入腹膜，導致促血管生成和免疫抑制生態系統。GSEA分析發現，G4組中的C3- DC細胞高表達了參與炎癥反應、NF-kappa B信號通路、趨化因子信號通路、上皮-間充質轉化和Notch信號通路的基因。相反，G3組中的C3-DC細胞高表達了參與抗原加工和呈遞、MHC-II受體活性和T輔助細胞分化的基因（圖4c）。
作者通過GSVA來評估G3組和G4組之間的單核細胞樣DC簇的代謝活性；G4組中C3-DC簇上調氧化磷酸化和糖酵解，并伴有透明質酸代謝和嘌呤代謝；C2-DC簇顯示線粒體功能下降，其特征是氧化磷酸化和脂肪酸線粒體氧化下調，糖酵解和丙酮酸代謝增加（圖4d）。全身治療顯著降低了C3-CD4 Treg細胞的比例，在GCPM期間增加，抑制和幼稚功能降低，提示免疫抑制狀態改善（圖4e-f）。此外，功能評分分析顯示，循環T細胞在抗腫瘤治療下（G4組）表現出細胞毒性/增殖功能降低，而幼稚功能增加，提示循環T細胞功能可能會因治療壓力而沉默，這種轉變可能是對抗腫瘤藥物的自我保護機制。代謝分析表明，循環T細胞在治療過程中經歷了明顯的代謝重編程，通過上調氧化磷酸化、檸檬酸循環和谷胱甘肽代謝，這可能與藥物代謝有關（圖4g）。
5、單核細胞樣DC和循環T細胞免疫檢查點的進化
癌癥免疫治療可以浸潤到實體腫瘤中來重塑免疫細胞的表型，但其對腹膜的影響尚不清楚。作者通過比較免疫治療（2例患者）和化療（3例患者）的腹水樣本，探索免疫檢查點變化。與化療相比，免疫治療中C2-DC和C3-DC的比例降低（圖5a），在功能上，C2-DC簇下調了抗原呈遞能力，而促血管生成能力沒有顯著變化，C3-DC簇在免疫治療中同時下調了抗原呈遞能力和促血管生成能力（圖5b）。通過比較兩組之間的C2-DC DEGs，發現免疫治療組的C2-DC細胞低表達MHC分子相關的基因。值得注意的是，免疫治療后的C2-DC細胞對促炎表型呈負向富集，且抗炎相關基因高表達（圖5c）。同樣，C3-DC和C3-Macro簇在免疫治療下表現出抗炎表型，NF-kappa B通路和促炎表型的負向富集，表明單核細胞樣樹突狀細胞和TAM樣巨噬細胞廣泛向抗炎表型轉移（圖5d）。為了研究免疫檢查點的表達模式，CD274（PD-L1）和PDCD1LG2（PD-L2）是PD-1相關免疫檢查點的兩種配體，在單核細胞樣樹突狀細胞和TAM樣巨噬細胞中很少表達。其他可以誘導T/NK細胞并隨后抑制其細胞毒性免疫檢查點如VSIR、MIF、LGALS9和SIGLEC10在C2-DC和C3-DC簇中表達，并且其在免疫治療（與化療相比）中增加（圖5e）。接下來，作者探討了在免疫治療過程中腹膜浸潤性T細胞的免疫表型變化，與化療相比，免疫治療中C2-CD4 naive和C3-CD4 Treg簇比例降低，表明免疫治療可能減少免疫抑制T細胞簇（圖5f）。此外，免疫治療導致共刺激標記基因CD27、CD69和TNFRSF14的表達增加。細胞功能分析表明，CD8 T細胞的百分比高細胞毒性功能略有增加，進一步的功能評分分析顯示，免疫治療并沒有明顯增強T細胞的細胞毒性，但可以增加具有高細胞毒性功能的CD8 T細胞的百分比（圖5g）。然而，免疫治療顯著誘導了幾個免疫檢查點的上調。免疫治療組C3-CD4 Treg簇在免疫治療后優先表達免疫檢查點基因CTLA4、TIGIT、CD47、CD96和TNFRSF1B，免疫治療后循環T細胞簇中VSIR、CD47、CD96和TNFRSF1B表達上調（圖5h）。
6、高可塑性GC通過一個保守的細胞程序演變為高增殖性GC
作者將所有上皮細胞分為7個簇，C1-3腫瘤簇幾乎被所有的GC病例所共享，而C4-7腫瘤簇僅在單個病例中存在（圖6a）。比較了C1-3簇的增殖、分化和可塑性等腫瘤特征，發現C1-腫瘤簇具有高度分化能力，C2-腫瘤簇具有高度可塑性，C3-腫瘤簇具有高度增殖能力（圖6b）。研究定義了一個上皮細胞可塑性程序，稱為paligenosis，分為特征不同的三個階段。paligenosis已被證明是分化細胞在癌前狀態如胃化生等狀態下回到祖細胞狀態的過程，本文推斷，GC主要源于化生病變，可能通過繼續使用paligenosis來維持治療的可塑性。c2-腫瘤簇具有高的自噬、高的可塑性和低的mTORC1活性，這是早期麻痹（1-2期）的特征。c3-腫瘤簇具有高的mTORC1活性和高增殖，是晚期paligenosis的特征。對C1-3腫瘤集群擬時序發現c1-腫瘤細胞增加了“分化”，減少“增殖”和“可塑性”表型。
GSEA分析發現治療后C2-腫瘤簇可塑性增強（G4組），表現為Hedgehog、ERBB通路激活和細胞極化重構（圖6c）。軌跡分析發現發現G3組的部分C2-腫瘤簇發展為G3組的C3-腫瘤簇，另一部分發展為G4組的高度可塑性的C2-腫瘤簇。在細胞軌跡的末端，G4組的C2-腫瘤細胞失去了一定的可塑性，獲得了增殖能力，發展為G4組的C3-腫瘤簇。整個發育軌跡是細胞可塑性的持續進化，導致細胞增殖（圖6d-f）。在C2-腫瘤-G4-Group簇富集的軌跡的中間，細胞具有上皮細胞的特征間充質轉化。在細胞軌跡的末端，C3-腫瘤-G4-Group簇富集，細胞以細胞周期進入和Wnt通路激活為特征，表明G4組的C3-腫瘤細胞在獲得增殖能力的同時保持了相當大的多能性（圖6f）。G4組的C2-腫瘤簇和C3-腫瘤簇均表現出代謝重編程和多藥耐藥性增加。G4組的C2-腫瘤細胞進一步表現為線粒體功能下降，糖酵解和糖原代謝增加（圖6g）。
7、自噬抑制阻斷胃癌PDOs的凋亡并誘導凋亡
為了研究GCPM過程中的細胞調控，對所有細胞簇進行了細胞通訊的分析，令人驚訝的是，最強的細胞通訊是在C2和C3腫瘤細胞之間（圖7a）。為了解碼調控C2和C3腫瘤細胞的分子網絡，在TCGA STAD數據庫中尋找C2腫瘤細胞的DEGs、自噬相關基因和GC患者預后相關基因之間的交叉點，只有MARCKS和TXNIP存在于C2腫瘤細胞簇的所有三個基因集中（圖7b）；C3腫瘤細胞未發現交叉基因（圖7c）。PDOs是針對癌癥患者的基因進化研究、生物標志物鑒定和藥物篩選的有效工具。對4例GCPM晚期胃癌患者的腹水樣本進行PDOs分析，MARCKS和TXNIP蛋白的表達與晚期（3期）麻痹癥標志物pS6和KI67的表達不相關，但它們與早期麻痹癥標志物DDIT4、ATF3以及SOX9（由2期誘導）共表達（圖7d），作者用自噬或mTORC1抑制劑治療腹水，因為自噬誘導和mTORC1激活分別是早期和晚期麻痹的標志。自噬和mTORC1抑制劑均能顯著降低了腹水的生長。與mTORC1抑制劑TORIN1和雷帕霉素相比，自噬抑制劑DC661和羥基氯喹對腹水生長的抑制作用更有效（圖7e，f）。發現只有DC661或羥基氯喹誘導了類器官死亡，這表明自噬和mTORC1抑制劑通過不同的機制阻礙生長（圖7e中紅色箭頭）。為了進一步分析自噬和mTORC1抑制劑治療后的類器官死亡特征，用自噬或mTORC1抑制劑處理的PDOs對CC3（(cleaved caspase3）和KI67進行染色。DC661和羥基氯喹顯著誘導腹水PDOs細胞凋亡，與未處理的對照組和mTORC1抑制劑處理的PDOs相比，CC3/KI67陽性細胞的比例增加，證實自噬抑制導致麻痹失敗，進而誘導細胞凋亡（圖7g，h）。
三、小結
本文描述了35例胃癌腹膜轉移（GCPM）患者的腹水癌/免疫細胞的單細胞轉錄組。在GCPM進展過程中，可見單核細胞樣樹突狀細胞（DCs）的增加，這些細胞具有促血管生成作用，抗原呈遞能力降低，并與胃癌（GC）預后不良相關。作者還探究了治療后單核細胞樣樹突狀細胞和調節性和增殖性T細胞的進化，比較了免疫治療和化療前后細胞變化和功能改變，最后使用細胞通訊和PDOs進行驗證。本文通過對不同時期的GC樣本進行單細胞測序，從而更加精準的劃分細胞亞型，進行不同細胞簇的差異對比，更加細致的刻畫了GCPM單細胞轉錄組景觀。
參考文獻：Huang XZ, Pang MJ, Li JY, Chen HY, Sun JX, Song YX, Ni HJ, Ye SY, Bai S, Li TH, Wang XY, Lu JY, Yang JJ, Sun X, Mills JC, Miao ZF, Wang ZN. Single-cell sequencing of ascites fluid illustrates heterogeneity and therapy-induced evolution during gastric cancer peritoneal metastasis. Nat Commun. 2023 Feb 14;14(1):822. doi: 10.1038/s41467-023-36310-9 . PMID: 36788228; PMCID: PMC9929081.
