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大家好，今天給大家做一個文獻(xiàn)解讀，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展和大量文章的發(fā)表，簡單的生物實驗、通路機制類的文章已經(jīng)不再新鮮，期刊雜志也不滿足于簡單的實驗類文章，生物信息學(xué)文章近年來大量發(fā)表，而文章中應(yīng)用到的生物信息學(xué)方法也內(nèi)卷嚴(yán)重，那么我們除了做簡單的生物信息學(xué)分析外，要多看多學(xué)多用，創(chuàng)新的算法與實驗結(jié)合，讓投文章更加簡單。
這個期刊的水平不用多說，中科院一區(qū)，OA雜志，11年出版，《Theranostics》創(chuàng)刊第2年即被SCI收錄，首個影響因子就有7.806分之高，此后三年逐年攀升，2015年后的連續(xù)三年下降終于開始上漲，在2019年達(dá)到峰值8.579分，今年更是達(dá)到了11.6分，隨著影響因子的通貨膨脹，預(yù)測接下來還會繼續(xù)升高。
首先這篇文章值得一提的是它的算法圖，不愧是一區(qū)的文章，圖的布局相當(dāng)好看，也十分恰當(dāng)把文章中的關(guān)鍵點、創(chuàng)新點直觀的展示給讀者。
本研究利用一種新的計算框架和10種機器學(xué)習(xí)算法(101種組合)，綜合分析低級別膠質(zhì)瘤（LGG）純化的免疫細(xì)胞、LGG細(xì)胞系和LGG大體積組織的測序數(shù)據(jù)，篩選出TIIC lncRNAs。
大家都知道，長鏈非編碼rna (long noncoding RNAs, lncRNAs)作用關(guān)鍵，可以參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，在免疫細(xì)胞亞群中表現(xiàn)出細(xì)胞類型的特異性模式。鑒于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞在有效免疫治療中的重要作用，研究者探索了在低級別膠質(zhì)瘤(LGG)中尚未發(fā)現(xiàn)的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞相關(guān)lncRNA (TIIClncRNA)。
說起來，腫瘤浸潤免疫細(xì)胞相關(guān)的lncRNA肯定是有很多相關(guān)的研究了，但作者選題角度也很刁鉆，選擇了癌癥研究較少的膠質(zhì)瘤，并進一步篩選出低級別膠質(zhì)瘤，這一點使得他的研究不是重復(fù)而無意義的了，選題新穎。
1.首先介紹一下作者的數(shù)據(jù)來源，無非就是這幾個常用的公共數(shù)據(jù)庫TCGA-LGG, CGGA數(shù)據(jù)庫，GEO數(shù)據(jù)庫的十六個膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集以及癌癥細(xì)胞系百科全書項目CCLE。
2.接下來是對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的處理，對芯片數(shù)據(jù)進行歸一化處理，F(xiàn)PKM數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為TPM數(shù)據(jù)，通過GENECODE數(shù)據(jù)庫對Lncrna探針進行注釋。
3.通過對純化的免疫細(xì)胞、LGG細(xì)胞系和LGG腫瘤組織的lncRNA分析，研究者利用一種新的計算框架，結(jié)合多種機器學(xué)習(xí)算法識別腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞相關(guān)lncRNA (TIIClnc) signature。
4.TIIClnc signature的免疫相關(guān)特征注釋：
收集到7種免疫調(diào)節(jié)劑。計算T細(xì)胞炎癥基因表達(dá)譜(GEP)、細(xì)胞毒活性(CYT)和干擾素γ (IFN-γ)。
從TCGA數(shù)據(jù)庫中收集腫瘤突變負(fù)擔(dān)(TMB)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、T細(xì)胞受體(TCR)豐富度、TCR Shannon和SNV Neoantigen。
使用GATK4從湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集的RNA測序數(shù)據(jù)中搜索snp和indel。
采用基于來自genome Reference Consortium(基因組參考聯(lián)盟)的智人基因組裝配體“GRCh38”的方差分析方法對突變信息進行標(biāo)注。進一步利用R軟件包maftools的tmb函數(shù)計算湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集的tmb值。利用R包PreMSIm對湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集的MSI值進行預(yù)測。
如前所述，確定了6種免疫亞型和immunophenoscore(IPS)。采用腫瘤免疫估計資源(TIMER)算法、單細(xì)胞基因集富集分析(ssGSEA)算法、微環(huán)境細(xì)胞種群計數(shù)器(MCPcounter)算法和利用表達(dá)數(shù)據(jù)(ESTIMATE)算法估計惡性腫瘤基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞，計算免疫浸潤細(xì)胞的豐度和ESTIMATE評分。
收集癌癥免疫周期，顯示趨化因子和免疫調(diào)節(jié)劑的功能狀態(tài)，并通過基因集變異分析(gene set variation analysis, GSVA)富集出114條代謝通路。使用GSVA進行計算，基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集，并使用gsva和基因集富集分析(GSEA)進行量化。
5.為了進一步體現(xiàn)TIIClnc signature對免疫治療反應(yīng)的預(yù)測價值，使用GSE35640(黑素瘤)、GSE91061(黑素瘤)、GSE78220(黑素瘤)、Allen(黑素瘤)、Nathanson(黑素瘤)、IMvigor(尿路上皮癌)、Braun(腎細(xì)胞癌)、GSE179351(結(jié)直腸腺癌和胰腺腺癌)、GSE165252(食管腺癌)和PRJNA482620(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)數(shù)據(jù)集預(yù)測免疫治療反應(yīng)，同時計算每個數(shù)據(jù)集的TIIClnc標(biāo)記。GSE103668(三陰性乳腺癌)數(shù)據(jù)集用于預(yù)測靶向治療反應(yīng)(順鉑和貝伐單抗)。亞類圖譜用于預(yù)測抗pd-1和抗ctla-4免疫治療反應(yīng)。本節(jié)也使用了Tumor Immune Dysfunction and Exclusion (TIDE)算法。
6.接下來是文章的實驗部分，使用了湘雅的膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)，做了RT-pcr數(shù)據(jù)，對LOC101928134和LOC100133461進行了表達(dá)量分析。
將三組轉(zhuǎn)染sirna的THP-1細(xì)胞離心，使用無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整密度為105個細(xì)胞/mL。上腔加入細(xì)胞懸液100 μL，下腔加入含10% FBS的1640 500 μL。培養(yǎng)48 h后收集下腔遷移的THP-1細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)。后續(xù)做了細(xì)胞實驗與染色。
圖2結(jié)果展示了TIIClnc信號的預(yù)后價值。這部分結(jié)果展示了各個算法組合后，對TIIClnc signature的篩選過程，并通過一系列生存分析和ROC曲線展示其重要性。
A.通過10倍交叉驗證框架，共有101種用于TIIClnc signature的機器學(xué)習(xí)算法組合。通過TCGA-LGG、湘雅內(nèi)部、CGGA-LGG和GSE108474等驗證數(shù)據(jù)集計算各模型的c-index。
B.基于CoxBoost算法的16個最具價值的TIIClncRNAs展覽。
C.基于RSF算法確定誤差最小的TIIClnc signature樹的數(shù)量，以及16個最有價值的TIIClncRNA的重要性。
D. TCGA- LGG、湘雅內(nèi)部、CGGA- LGG和GSE108474數(shù)據(jù)集中TIIClnc signature得分高和TIIClnc signature得分低的患者的OS生存曲線Kaplan-Meier。
E. CGGA-LGG、湘雅內(nèi)部、TCGA-LGG和GSE108474數(shù)據(jù)集1年、2年、3年、4年和5年OS的時間依賴性ROC曲線，顯示了這組 signature具有較好的穩(wěn)定性。
圖3. TIIClnc signature與其他模型的比較。通過不同數(shù)據(jù)集進行比對，并引入了其他隨訪數(shù)據(jù)進行比對。
A. TCGA-LGG、湘雅內(nèi)部、CGGA-LGG和GSE108474數(shù)據(jù)集的TIIClnc signature、其他臨床因素和組合 signature的C-index。
B. TCGA LGG、湘雅內(nèi)部、CGGA LGG和GSE108474數(shù)據(jù)集中的TIIClnc特征的1年、2年和3年校準(zhǔn)曲線。
C. TIIClnc signature的C-index和TCGA LGG數(shù)據(jù)集中開發(fā)的其他模型。
D. TIIClnc signature的C-index和湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集中開發(fā)的其他模型。
E. TIIClnc signature的C-index和CGGA LGG數(shù)據(jù)集開發(fā)的其他模型。
F. TIIClnc signature的C-index和GSE108474數(shù)據(jù)集中開發(fā)的其他模型。
圖4. 湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集中TIIClnc signature的免疫相關(guān)特征，TIIClnc signature與免疫細(xì)胞浸潤與免疫調(diào)節(jié)進行熱圖分析，研究他們之間的相關(guān)。
A.顯示TIIClnc信號與免疫浸潤細(xì)胞相關(guān)性的熱圖。
B.顯示TIIClnc signature與免疫調(diào)節(jié)分子之間相關(guān)性的熱圖。
C.顯示兩個TIIClnc signature評分組之間的CYT水平的小提琴圖。
D.顯示兩個TIIClnc signature得分組之間的GEP水平的小提琴圖。
E.顯示兩個TIIClnc signature評分組之間IFN-γ水平的小提琴圖。
F.顯示兩個MSI組間TIIClnc水平的小提琴圖。
G.顯示兩個TIIClnc signature分?jǐn)?shù)組之間TMB水平的小提琴圖。
H.兩個TIIClnc signature得分組之間IPS級別的小提琴圖。
圖5. TIIClnc signature對免疫治療反應(yīng)的預(yù)測價值，根據(jù)TIIClnc signature對數(shù)據(jù)集的評分對預(yù)后數(shù)據(jù)進行評價。
A. IMvigor數(shù)據(jù)集中TIIClnc評分高與TIIClnc評分低的患者間OS的Kaplan-Meier生存曲線。
B. IMvigor數(shù)據(jù)集中顯示不同免疫治療反應(yīng)患者TIIClnc signature評分的箱線圖。
C.顯示GSE179351數(shù)據(jù)集中不同免疫治療反應(yīng)患者TIIClnc signature評分的框圖。
D. Braun數(shù)據(jù)集中TIIClnc評分高和TIIClnc評分低的患者之間的OS生存曲線。
E. Braun數(shù)據(jù)集中顯示不同免疫治療反應(yīng)患者TIIClnc signature評分的方框圖。
F.顯示GSE103668數(shù)據(jù)集中不同免疫治療反應(yīng)患者TIIClnc signature評分的方框圖。
G.顯示GSE165252數(shù)據(jù)集中不同免疫治療反應(yīng)患者TIIClnc signature評分的框圖。Allen數(shù)據(jù)集中TIIClnc評分高和TIIClnc評分低的患者的OS生存曲線。
I. Allen數(shù)據(jù)集中顯示不同免疫治療反應(yīng)患者TIIClnc signature評分的方框圖。GSE78220數(shù)據(jù)集中TIIClnc高評分和TIIClnc低評分患者OS的J. Kaplan-Meier生存曲線。
K. Box圖顯示GSE78220數(shù)據(jù)集中不同免疫治療反應(yīng)患者的TIIClnc signature評分。Nathanson數(shù)據(jù)集中TIIClnc評分高和TIIClnc評分低的患者之間的OS生存曲線。
M. Box圖顯示Nathanson數(shù)據(jù)集中不同免疫治療反應(yīng)患者的TIIClnc signature評分。
N. Box圖顯示GSE35640數(shù)據(jù)集中不同免疫治療反應(yīng)患者的TIIClnc signature評分。
O. Box圖顯示GSE91061數(shù)據(jù)集中不同免疫治療反應(yīng)患者的TIIClnc signature評分。
P.湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集中基于TIDE算法的免疫治療反應(yīng)與TIIClnc signature評分組的聯(lián)列表。
Q.基于湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集的子圖分析，免疫治療反應(yīng)(anti-PD-1和anti-CTLA-4)和TIIClnc signature評分組之間的聯(lián)列表。PRJNA482620數(shù)據(jù)集中TIIClnc得分高和TIIClnc得分低的患者之間的OS生存曲線。
圖6. 之后作者通過實驗驗證進一步證明了分析的準(zhǔn)確性。
A.散點圖顯示了湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集中TIIClnc signature評分與CD8、PD-1、PD-L1之間的相關(guān)性。
B. Box圖顯示湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集中兩個TIIClnc signature評分組之間基于IHC染色的CD8、PD-1和PD-L1的h評分水平。h評分用強度評分*數(shù)量評分計算。強度得分為0、1、2、3，分別為負(fù)、弱、中、強。數(shù)量得分0、1、2、3、4分別代表10%、10-25%、25-50%、50-75%、75%染色細(xì)胞的比例。H-score的取值范圍為0 ~ 12。
C.湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集中兩個TIIClnc signature評分組中CD8、PD-1和PD-L1的代表性IHC染色圖像。
圖7.湘雅內(nèi)部數(shù)據(jù)集中TIIClnc signature的功能注釋，對 signature進行功能學(xué)分析，是文章與臨床更巧妙的結(jié)合起來。
A.兩組TIIClnc signature評分組癌癥免疫周期差異的方框圖。
B.基于GO和KEGG項的gsa顯示TIIClnc標(biāo)志評分與代謝通路、免疫相關(guān)通路的相關(guān)性蝴蝶圖。免疫圖雷達(dá)圖顯示了
C. Kobayashi和D. Bagaev開發(fā)的TIIClnc signature評分和TIME signature之間的相關(guān)性。
E. GSEA的GO 富集中TIIClnc signature分?jǐn)?shù)。
F. GSEA的KEGG富集中TIIClnc signature得分。
文章小結(jié)：
研究者基于豐富的機器學(xué)習(xí)算法對純化的免疫細(xì)胞、LGG細(xì)胞系和大量LGG組織的測序數(shù)據(jù)進行綜合分析，開發(fā)出一種穩(wěn)定、魯棒的TIIClnc signature來分層LGG患者和預(yù)測免疫治療的結(jié)果。其中的機器學(xué)習(xí)方法很值得我們借鑒。
