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哈嘍，各位同學大家好~好久不見，分外想念呢。今天想和大家分享的是一篇關于癌癥起源的文章（Cell Rep，9.4233）。癌癥很可怕，但比癌癥更可怕的是癌癥轉移，癌細胞擁有無限的生長能力，增殖能力和轉移能力。一旦發生轉移，癌細胞就會侵入人體其他組織器官，導致器官衰竭甚至死亡。此外，在癌癥轉移發生后，很多癌癥治療方法都會受到限制，治療難度大大提高。然而，現階段研究對“轉移細胞是如何產生的”這一問題尚不清楚。引起轉移的細胞必須首先在原發腫瘤內獲得促轉移狀態，再參與遷移機制，并最終在其他地方形成繼發腫瘤塊。那么這種促轉移狀態以及轉移細胞又是如何產生的呢？就讓我們一起帶著這個問題開始今天的文獻學習之旅吧。
日內瓦大學的科學家們通過尋找誘導最近表征的促轉移狀態，作為轉移起源的替代物，并進一步探究細胞死亡誘導療法是否會誘導人類結腸癌細胞的促轉移狀態。最終發現一類獲得促轉移狀態的瀕死細胞（PAME），并發現其擁有在體內形成遠端轉移的能力。這些PAME細胞表現出細胞因子風暴，內質網(ER)應激和核重編程能力增強等特點。PAMEs誘導鄰近腫瘤細胞成為PAME誘導的遷移細胞(PIMs):其同樣擁有高度遷移能力，重現細胞因子風暴并增強PAME遷移（圖解摘要）。因此，研究者認為瀕死細胞可以通過內質網應激調節、轉移重編程和細胞因子風暴獲得促轉移能力。
圖解摘要
On the origin of metastases: Induction of pro-metastatic states after impending cell death via ER stress, reprogramming, and a cytokine storm
轉移的起源:通過內質網應激、重編程和細胞因子風暴誘導細胞瀕臨死亡后的促轉移狀態
1.瀕死細胞活下來，就成了我：PAME
對異質結腸癌CC14細胞進行細胞致死STS處理（激酶抑制劑十字孢堿觸發晚期凋亡細胞的存活），6 h后用凋亡抑制劑Q-VD-OPh + DIDS進行阻斷（圖1A-B）。僅用DMSO或BLOCK處理的細胞(對照組)不受影響(圖1B)，而用STS處理的細胞100%死亡并出現凋亡表型(圖1B-C)。STS + BLOCK處理 5天后部分PAMEs被挽救并出現增殖(圖1C)。PAMEs經慢病毒轉染后均為lacZ+，并經XGal染色鑒定(圖1D)。而單獨的BLOCK無效，PAMEs的遷移細胞數量增加12倍(圖1D)。在其他結腸癌CC36，Ls174T， DLD1等細胞株中均可觀察到相似現象(圖1E-F）。將CC14 PAME lacZ移植到裸鼠中(圖1H)，與DMSO/DMSO或對照(DMSO/BLOCK)組相比，肺遠端轉移瘤分別增加3.4倍和1.5倍(圖1H)，表明存在內源性凋亡細胞的挽救現象。從CC14 PAME原發腫瘤中移植的細胞顯示出2倍的遷移能力(圖1I)，表明PAME后代在多次分裂后仍保持著較強的轉移能力。
圖1. PAMEs表現出穩定、增強的遷移和轉移能力
2.凋亡阻斷劑相關的多種藥物誘導PAME
通過regorafenib和BLOCK處理4天后，細胞數量達到原來的30% - 40%。經過2天的恢復和擴展后，PAMEs REG顯示出2.5倍的遷移能力(圖1G)。此外，用非apocalyptic STS處理，然后在不含BLOCK的環境培養7天后，細胞的遷移能力提高4倍，其他臨床相關化療藥物處理后，細胞遷移能力也表現出不同程度的增強(圖1J)。
3. PAMEs中分泌性、干性和轉移性重編程因子表達增強
研究者進一步對PAME-CC14（STS PAMEs）和對照細胞進行RNA-seq測序分析，在STS PAMEs中細胞因子信號轉導、炎癥/免疫反應和細胞外基質組織相關基因表達上調，有利于細胞因子風暴的形成。額外的qRT-PCR分析顯示SNAIL1、ZEB1和VIM在PAMEs中升高2倍或更多(圖2B)，提示在此過程中EMT能力增強。此外，所有被檢測的結腸癌PAMEs都具有高水平表達的干細胞標記物NANOG/NANOGP8(圖2B)，并且大多數也表達高水平的轉移性重編程因子OCT4、SOX2和KLF4 (圖2B)。
圖2. PAME轉錄組分析和PIM誘導
4. PAMEs誘導鄰近癌細胞成為高度遷移的PIMs
分別將RFP+CC14細胞與對照細胞和PAMEs共培養，相比對照組，與PAMEs共培養的細胞其遷移能力增加9倍(圖2C-D)。被PAMEs誘導獲得高度遷移能力的腫瘤細胞被稱為PIMs (PAMEs誘導遷移細胞)。PAMEs GFP和PIMs RFP的基因表達分析表明PAMEs中上調的重編程/干性特征在PIMs中缺失(圖2E)。然而，兩種細胞在顯著上調和顯著下調的top基因中表現出明顯重疊(圖2E)。為測試PIM誘導擴散的可能性，研究者使用C11細胞進一步檢測PIM (PIMs1)誘導更多PIM (PIMs2)的能力。PAMEs誘導的PIMs1被FACS分離，其遷移能力增加26倍(圖3A-B)。此外，經PIMs1誘導后生成的PIMs2同樣保持高度遷移能力，雖然這種能力稍低于PIMs1（圖3C-D）。此外，研究者發現在遷移能力越強的細胞中，INSL4和IL32表達越高（圖3E-F）。PIM誘導在傳播過程中遷移能力逐漸下降。
5. PITS 分泌誘導PIM是一種常見現象
研究者預測PIM誘導會分泌細胞因子風暴(PITS)，因此進一步測試PAME培養基對PIM的誘導(圖3G)。在研究者發現來自不同細胞甚至多個細胞的PAMEs培養基(CM)誘導的PIMs相比對照CM處理的同類型細胞均發生不同程度的增加 (圖3H-J)。
圖3. PIM誘導和條件培養基
6. PIMs與PAMEs關聯并發生共同遷移
與對照組相比，將CC14 PIMs移植到裸鼠中并沒有增加其轉移能力(圖3K)。因此研究者推測PIMs可能會幫助PAMEs轉移。標記共培養物的延時照片分析顯示PAME-PIM細胞的關聯頻率是對照-對照細胞的10倍(圖4A和4B)。這種關聯很密切，在共焦顯微鏡中出現黃色重疊區(圖4C)。梭形細胞形態（通常與主動遷移有關）在20%的PAMEs中存在，但在對照細胞中非常少見(圖4C)。與PIMs-RFP相關的PAMEs-GFP表現出這種表型的頻率是單獨PAMEs的兩倍(圖4C)。對24小時后穿過過濾器的細胞進行染色，當超過95%的細胞為單一細胞時，顯示CC14 PAME-lacZ與PIM-AP混合后細胞比對照混合細胞增加2.5倍(圖4D)，并且這種趨勢可以保持4天。以上結果表明PAMEs-lacZ與PIM-AP的相關性比對照組lacZ、AP混合物增強4倍(圖4D-E)。此外，與PAMEs單獨培養或PAMEs- lacz與細胞分選后的PAMEs- GFP /AP共培養相比，PAMEs-PIMs共培養細胞的的遷移增加4倍(圖4F)。PIM培養基對PAME遷移沒有影響(圖4G)。當PAME與PIM共同存在時的轉移效率比PAME與PAME共同培養時提高1.8倍(圖4H)。
圖4. PAMEs/ PIM的關聯和遷移及常見細胞因子風暴的識別
7. PIM和PAME轉錄組的相似性
與對照組相比，PAMEs和PIM存在顯著交疊的差異表達基因，其中炎癥反應、細胞因子活性、細胞遷移的正向調節以及分泌因子相關基因在PAMEs和PIM中同時上調，并且存在頻繁的蛋白質互作(圖4I-J)。此外，與對照組相比，12個細胞因子蛋白在CC14-PAME培養基中表達豐度增加2倍（圖4K），表明PITS 含有多種細胞因子和分泌因子。
8. PITS與CXCL8、MIF、EGFR、COX2、IL32和INSL4的活性相關
CXCL8在PAMEs和PIM中上調，在蛋白質互作網絡和細胞轉移過程中發揮關鍵作用。研究者在CC14細胞中加入CXCL8配體后，其遷移細胞數量增加(圖5A)。相比之下，CXCL1配體加入后遷移細胞數量下降 (圖5A)。為抑制內源性CXCL8功能，研究者將一種CXCR1/CXCR2受體阻斷劑添加到培養皿中，預處理1小時后發現PAMEs誘導的PIM遷移量減少2倍(圖5B)。
AZD-5069是另一種CXCR2的拮抗劑，但AZD-5069處理后未觀察到遷移變化(圖5B)，表明CXCL8通過CXCR1發揮作用。由于0.1-1 ug/mL的CXCL8(圖5A)不能表現出PITS的強度(圖3G-H)，研究者進一步在PAMEs中測試其他上調因子的影響。ISO-1處理PAME誘導PIM后，PIM遷移率降低30%(圖5B)。在PAME中AREG上調后遷移能力增加(圖5A)，而用西妥昔單抗阻斷其受體EGFR的活性會導致PIM遷移的減少(圖5B)。
IL32和INSL在PAMEs和PIM中上調，參與遷移和侵襲調節過程。IL32誘導遷移能力增強(圖5A)。在CC14細胞中，通過cDNA轉導直接表達INSL4可使細胞的遷移行為增強2倍(圖5A)，這與CXCL8無關。與CXCL8不同，在藥理學上無法阻斷INSL4作用(圖5B)，而且由于其在PAMEs中的誘導作用非常高，因此難以充分抑制INSL4，這促使研究者構建CRISPR-Cas9雙突變克隆，刪除其啟動子ATGs。在體外，INSL4和IL32突變體使遷移能力和遠端轉移能力顯著下降(圖5C)。
9. PAMEs和PIM顯示單細胞定義的促轉移狀態
研究者先前的scRNA-seq工作分析識別出一類METSP(促轉移細胞亞群，圖5D)，CXCL8、INSL4和IL32在METSP中高表達 (圖4J)。為進一步確定PAMEs和PIM是否表現出METSP促轉移狀態，研究者將在RNA-seq(也在scRNA-seq中檢測到)中常見的PAME/PIM上調和下調基因映射到四個先前定義的scRNA-seq簇(圖5D- E)。PAME/PIM上調基因主要在METSP中表達，而下調基因則映射到非METSP中 (圖5E)。在PAME/PIM中上調且顯著富集到METSP中的基因主要與浸潤，細胞因子活性等生物學過程相關(圖5F)。
圖5.PAMEs和PIMs與多功能細胞因子風暴相關，并表現出促轉移
10. PAMEs與內質網應激
METSP細胞內質網應激相關基因，如DDIT3(編碼CHOP)、HSPA5(編碼BIP)、ATF 等表達增強(圖6A)。一致地，研究者發現在PAME-CC14和PAME-C11中，發生剪接的XBP1、DDIT3和HSPA5的表達水平有所提高(圖6B)。鑒于內質網應激和轉移之間的聯系，研究者進一步測試高度內質網應激對驅動遷移能力的影響。經內質網應激誘導處理后的CC14和E3細胞中DDIT3和HSPA5表達升高，遷移能力降低(圖6C，藍條)。研究者進一步基于PERK抑制劑(PERKi;GSK2606414)測試內質網應激相關通路PERK-ATF4- CHOP對遷移的影響。PERKi處理增強其遷移能力，降低DDIT3和HSPA5表達(圖6C和6D)， PERKi和內質網應激誘導處理相互平衡(圖6C)。此外，遷移活躍的PAMEs-C11和PIM中內質網應激標記物水平降低(圖6E)，這與遷移的CC14細胞中HSPA5下調一致，但其他METSP基因保持不變(圖6E)。PERKi阻斷PREK，進一步增強PAME-CC14和PAME-C11的細胞遷移(圖6F-G)。
圖6. 內質網應激調節PAME遷移能力
11. CHOP、NANOG和GLI參與PAMEs
CHOP是PERK的下游因子，研究者通過敲除DDIT3驗證其對遷移的影響。DDIT3敲除后PAME細胞的遷移能力顯著下降(圖7A)。然而，除NANOG/P8和GLI1沒有明顯表達增加外，DDIT3敲除PAME中的PAME特征仍然存在(圖7A)。因此，研究者推測CHOP對于轉移性PAMEs重編程是必要的。研究者進一步直接測試NANOG的作用，發現NANOG在癌細胞中是由轉移性重編程誘導以及增強轉移狀態所必需的，并與GLI1發揮協同作用。NANOG/NANOGP8敲除未觀察到GLI1和CXCL8的上調以及轉移能力的增強(圖7B)。
上述結果提示GLI基因可能在內質網應激和轉移性重編程/NANOG之間發揮關聯作用。因此，研究者進一步探究內質網應激增強是否可以激活GLI1。內質網誘導處理后GLI1表達升高(圖7C)。GLI1的表達導致NANOG/P8上調，IL32增強(圖7C)，GLI3影響IL32和CXCL8，抑制INSL4(圖7C)。因此，研究者認為主要是由GLI1，而不是GLI3負責調節PAME特征和內質網應激水平的反饋，以及DDIT3表達升高 (圖7C)。
以上結果表明在被攻擊后僥幸存活的人類結腸癌細胞，可以通過細胞重塑，誘導促轉移狀態。瀕死細胞可以通過內質網應激調節、轉移重編程和細胞因子風暴獲得促轉移能力。 (圖7D-E)。
圖7. 通過CHOP、NANOG和GLI參與的PAMEs誘導轉移發生
據報道，除非腫瘤過大，壓迫到重要臟器以外，絕大部分癌癥病人并不是直接死于原發腫瘤。然而，癌細胞轉移會使腦，骨等重要器官收到侵害，數據顯示90%的患者死于癌癥轉移。所以癌細胞的轉移，對控制和治療腫瘤是至關重要的。在本篇文章中，研究者將誘導最近表征的促轉移狀態作為轉移起源的替代物。通過誘導瀕死細胞并測試其轉移、遷移能力，發現這些本應死亡的細胞會自我重新編程，然后呈現出更高的轉移風險。此外，研究者還發現細胞瀕死狀態產生內質網應激，從而使PAME細胞得以發育以及細胞因子風暴產生。該研究為新的癌癥轉移治療策略鋪平道路，有利于防止某些由于治療產生的促轉移區域的發展。PAME細胞可能是未來潛在的治療和轉移預防靶點。
以上研究主要是基于實驗方法探索轉移起源，那么在我們生物信息學分析中，又該如何定義影響癌癥患者轉移的關鍵因素呢？下面小編還想和大家分享一個探究人類癌癥轉移的數據庫：HCMDB。
腫瘤轉移是癌癥患者死亡的主要原因。在過去十年中，高通量技術已經提供與癌癥轉移相關轉錄組變化的全基因組概括。許多微陣列和RNA測序研究致力于尋找不同類型癌癥的轉移相關表達模式。然而，這些表達數據僅僅被分散存儲在各個數據庫中，缺乏一個集成的數據挖掘平臺，并對這些數據進行高效地分析挖掘。為便于對轉移相關轉錄組數據的深入分析，研究者對這些轉移相關的表達數據進行全面整合，并構建出HCMDB(人類癌癥轉移數據庫，http://hcmdb.i-sanger.com/index)，在這里我們可以免費查詢跨平臺轉移的轉錄組數據。
圖8. HCMDB數據庫
HCMDB的大規模轉錄組數據主要來源于GEO、SRA、TCGA數據庫。在當前版本的HCMDB中，包含來自超過455個實驗的29種癌癥類型。為注釋這些潛在的轉移相關基因，研究者從7000多篇發表的文獻中收集2183個基因(1901個蛋白編碼基因，24個lncRNA和203個miRNAs)，構建易于使用的癌轉移相關基因查詢和瀏覽界面。
表1. HCMDB的數據資源
該數據庫提供搜索功能，可以提供相關基因基本信息，以及在轉移樣本中的表達變化：
圖9.檢索功能
圖10.轉移相關基因的表達分析
此外，研究者還可以對不同數據中在轉移與非轉移樣本中差異表達基因等進行檢索，并提供可視化結果。
圖11.差異表達基因及其可視化結果
當然，本文提供數據集合以及實驗支持基因轉移相關數據集下載。
圖12.數據下載
除轉錄組差異外，近期發表于CELL的一篇文章也對癌癥轉移的基因組特征進行探究，該工作主要基于整合大規模基因組和臨床數據，確定不同腫瘤類型轉移模式和基因組改變之間的關聯，為研究轉移擴散的生物學基礎提供寶貴的資源，并強調染色體不穩定性在癌癥進展中的復雜作用，在這里我們就不重點介紹了，感興趣的小伙伴們一定要自己去看哦。
圖13. 癌癥轉移的基因組特征
癌細胞固然極其“可恨”，但是它頑強的意志品質卻值得我們每個人學習。希望我們都能像“癌細胞”一樣頑強，哪怕是只有一線生機，也絕不放棄任何前進的希望。今天的分享到這里就結束啦，我們下次再見~
參考文獻：
1.On the origin of metastases: Induction of pro-metastatic states after impending cell death via ER stress, reprogramming, and a cytokine storm
2. HCMDB: the human cancer metastasis database
3. Genomic characterization of metastatic patterns from prospective clinical sequencing of 25,000 patients
