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腫瘤殺傷作用機制主要通過被抗原激活后的T細胞釋放顆粒酶和穿孔素，對T細胞的多項研究發現存在很多不同功能狀態的T細胞，其對免疫反應可能起到促進或抑制作用。今天給大家分享一篇發表在Nature Reviews Cancer（IF：69.8）雜志上的綜述性文章，這篇文章詳細描述了腫瘤反應性T細胞中不同類別細胞在分化、毒性、自我更新能力、增值能力等方面的特性，免疫組化、流式、質譜、單細胞等多項技術都可用于T細胞功能研究，而當下流行的scTCRseq技術，使得可以追蹤不同T細胞在腫瘤進化過程中的動態變化。本文全面揭示了抗腫瘤T細胞免疫相關因素，可用于指導基于T細胞的各種免疫療法的臨床治療。下面讓我們正式開始吧~
研究背景
T細胞是免疫系統殺傷腫瘤細胞的主力軍，是免疫治療異質性研究關鍵點之一。隨著單細胞技術的發展，當患者進行如免疫檢查點抑制劑、過繼性細胞療法、癌癥疫苗等免疫治療方案時，研究腫瘤免疫微環境中T細胞的細胞狀態的動態變化，特別是腫瘤特異性反應T細胞亞群特征成為可能。
T細胞免疫反應是通過TCR來完成，當機體受到抗原刺激時，通過TCR與MHC呈遞抗原復合物相互作用，產生效應淋巴細胞，能夠穿越組織并消除目標抗原，以及產生記憶細胞，它們可以在抗原再次攻擊的情況下持續存在并提供長期保護。每個T細胞表面具有獨一無二的TCR分子，對TCR的克隆性研究可以跟蹤在癌癥免疫治療干預過程中抗腫瘤性T細胞分化軌跡、克隆進化以及表型變化。
研究結論
本綜述詳細闡述腫瘤特異性反應T細胞中不同類別在分化程度、細胞毒性、自我更新能力、抗原負荷、增殖能力、人體分布位置等方面的差異，TCR序列分析進一步揭示TME中不同T細胞狀態與T細胞克隆性增殖相關性，追蹤T細胞克隆動態和腫瘤進化過程。結合單細胞技術研究進展揭示癌癥免疫治療反應性T細胞特征，闡明與產生抗腫瘤T細胞免疫相關的因素，未來可用于指導設計更有效的治療策略。
研究成果
TIL
在原生態的腫瘤微環境中，免疫T細胞可以浸潤到腫瘤組織內部，也可以識別部分抗原表位，但無法完全消除腫瘤細胞。一方面可能是因為腫瘤細胞有限的免疫原性，而小鼠慢性抗原刺激模型和熱腫瘤中TIL特征研究結果顯示，抗腫瘤T細胞在癌癥進展過程中逐漸出現功能障礙，從而引發免疫逃逸，恢復腫瘤免疫微環境中TILs的功能成為現在免疫治療的重點。
目前scRNA數據主要通過去卷積方法從混合轉錄本數據中對T細胞進行亞群分類，由于T細胞廣泛的功能狀態、特異性TCR的數量龐大、T細胞反應在時間和組織間隔上是動態的，需要進行縱向樣本收集，增大了分析難度。而把scRNA、scTCR-seq等單細胞技術和下面列舉的多種其它免疫研究方法結合，可以提高T細胞亞群分析能力和準確性。
1）免疫組化技術直接對CD8+T細胞和CD4+T細胞計數，從而將腫瘤分為免疫學上的熱腫瘤或冷腫瘤；通過有限的細胞標志物，多重免疫組化和免疫熒光可以獲得特性細胞群體的細胞狀態信息，同時保留定量和位置信息。
2）多參數流式細胞術可以對腫瘤組織解離后的單細胞懸浮液，利用有限細胞標志物，體外分離成不同T細胞亞群（<30），使得體外研究T細胞免疫反應性增殖和細胞因子產生成為可能。
3）金屬同位素（>40）標記抗體對單細胞染色，結合飛行時間質譜技術，對特定單細胞表面蛋白進行檢測。
4）scRNAseq對不同T細胞亞群表型特征進行研究，推測分化軌跡，scTCR-seq分析TCR克隆性，進一步確定T細胞的殺傷能力。隨著抗原特異性篩選工具的出現，提供了關于可以結合TCR的表位的信息，從而刺激T細胞的細胞毒性活性。
圖1. CD8+T細胞不同分化亞群
腫瘤免疫浸潤T細胞（TIL）是影響癌癥患者預后的重要因素，包括腫瘤內、腫瘤邊緣T細胞檢測以及腫瘤內T細胞毒性檢測。不同癌癥類型微環境中存在不同細胞狀態的T細胞，這里的不同指的是細胞分化程度、細胞毒性、增殖能力和干細胞潛能的不同。“熱”腫瘤通常富集CD4+T和CD8+T細胞，這類T細胞來源于前體T細胞被抗原刺激后激活和分化產生。
TCR克隆性
腫瘤免疫微環境中CD4+和CD8+ T細胞具有不同的表型，而腫瘤免疫作用取決于它們通過TCR參與接收的主要信號，在胸腺發育過程中V（D）J重組形成的TCR獨特的分子條形碼，可以用來檢測和跟蹤T細胞在不同時間段和身體部位的克隆動態。TME中的主要克隆通常被用作腫瘤抗原局部識別的間接證據，當對基于離散免疫標記分離的TILs細胞亞群進行TCR測序，可以更詳細地了解特定T細胞狀態與TME內克隆擴增相關性以及推斷TME內T細胞克隆進化情況。有研究發現，大部分TILs克隆具有非重疊的PD1+或PD1-分布，這表明單個T細胞克隆傾向于優先獲得耗竭或非耗竭表型，克隆擴增CD8+TIL優先顯示耗竭表型。單細胞轉錄組分析加上 scTCR-seq（檢測到配對的TCRα鏈和β鏈信息），為TME內克隆型動力學的表征提供了前所未有的分辨率。最近對黑色素瘤的TILs進行TCR測序分析發現，Tex具有較低的TCR多樣性，與高腫瘤內克隆擴張一致，而Tex細胞的TCR克隆可以在Tpe和Tte中追蹤到，提示這些不同細胞狀態存在一個連續體。克隆擴增的TCR也可以在Tmem細胞內觀察到，但它們與Tex細胞的TCR是不同的且不重疊，表明抗原特異性在塑造T細胞表型屬性中起著關鍵作用。
除了TME中T細胞克隆性的測量外，其他研究還試圖基于不同解剖位置的對比分析來推斷抗腫瘤特異性T細胞克隆分布模式。一項對RCC TME的研究報告稱，腫瘤組織TCR多樣性比正常組織低（即克隆擴展的TIL更多），與腫瘤抗原識別驅動的細胞擴張的概念一致，寡克隆與獲得耗竭的表型有關，并隨著疾病分期的加深而逐漸增加。多項實體瘤研究發現，TME中Tex細胞中擴增的CD8+TCR克隆型在外周血中很少檢測到，平均占循環T細胞庫的0.1%，而在腫瘤內Tmem細胞中發現的克隆型很容易在外周檢測到，占循環T細胞的10%-15%。
定義腫瘤特異性反應T細胞
腫瘤特異性反應T細胞即T細胞對腫瘤細胞或腫瘤抗原具有反應性，TCR主克隆對應細胞群通常代表具有局部抗原反應的T細胞亞群，但有研究表明大部分克隆擴增TILs并不具備抗腫瘤活性。一項大型肺癌和結直腸癌研究發現，具有非耗竭表型的CD8+ TILs能夠識別廣泛的病毒表位（EBV、CMV和流感等），但由于缺乏激活或衰竭標記以及無法識別腫瘤抗原，這種存在于TME中的Tmem細胞被歸類為“旁觀者”。病毒特異性淋巴細胞表現出優先記憶表型這一事實并不令人驚訝，因為記憶細胞通常是在抗原負荷被清除后急性感染后產生的。“真正的”抗腫瘤TIL的特征需要區別于旁觀者，即證明T細胞對腫瘤細胞或腫瘤抗原的反應性。
腫瘤抗原包括兩大類，腫瘤相關抗原（TAAs）和腫瘤特異性抗原（TSAs），前者在腫瘤細胞和正常細胞都有表達，但在腫瘤細胞中表達模式是異常的，后者只在腫瘤細胞中有表達。
TILs去卷積還有一大難點是無法確定對自體腫瘤細胞具有抗腫瘤活性的TCR，而通過在體外將表達TCR序列細胞和腫瘤細胞進行反應測定具有挑戰性，因為大多數腫瘤細胞在體外繁殖能力差。對于黑色素瘤患者來說，建立自體來源的細胞系是最可行的。有研究證明，在黑色素瘤中表達抑制性受體的CD8+TIL，如PD1、LAG3和TIM3（即Tex細胞），在體外純化和攻擊自體腫瘤細胞時，顯示出最高水平的激活（即CD137表面上調）、效應細胞因子（如干擾素γ）的分泌和靶向溶解。其他一些研究雖然沒有直接評估腫瘤反應性，但通過多肽-主要組織相容性復合體（MHC）多次染色證實了腫瘤抗原特異性T細胞的耗竭表型。
病毒特異性旁觀者T細胞是如何被招募到腫瘤免疫微環境中的，可能通過如下幾種方式：
1）具有Tmem表型的細胞能夠通過表達不同的歸巢（CD62L和CCR7）和遷移受體（細胞間粘附分子1（ICAM1）和血管粘附分子1（VCAM1））在次級淋巴器官和外周組織之間循環；
2）大多數腫瘤同時表現為高血管化和炎癥（盡管程度取決于不同的腫瘤類型），可能導致T細胞吸引和定植；
3）病毒特異性T細胞在循環中以高頻率被檢測到，這增加了它們在TME內再循環的可能性。
不管導致病毒特異性T細胞歸巢進入TME的機制是什么，我們不能排除，一旦進入TME，它們可能潛在地參與抗腫瘤活性，這是最近提出的由炎癥線索觸發的間接和TCR獨立激活。
抗腫瘤活性TILs
scTCR-seq可以得到T細胞配對的TCRα鏈和β鏈信息，通過體外合成瘤內TCR導入報告細胞，和自體腫瘤細胞共培養，通過測定抗原特異性激活來篩選治療性T細胞。TILs的擴增數量并不等同于抗腫瘤反應性，這很大程度上取決于腫瘤類型。一項黑色素瘤研究發現，TME內的抗腫瘤T細胞存在于從Tpe、Tte和Trm-like Tex表達狀態分化的連續體中。與之形成鮮明對比的是，Tmem TILs占腫瘤特異性區室的比例不到2%。進一步的研究將scTCR-seq和全轉錄組分析與體外篩選TCR對有限腫瘤抗原的特異性結合起來（圖2），以評估TME內抗腫瘤特異性的廣度。這一系列深入的研究一致表明，實體腫瘤中的腫瘤特異性T細胞幾乎完全存在于Tex細胞中，腫瘤表達抗原的特異性，而不是抗原類別本身（TAA or TSA），驅動TME內的T細胞耗竭。腫瘤反應性TILs的特征現在越來越多地用于腫瘤活檢中推測的腫瘤反應性TILs的預測，如檢測TILs中PD1和CD39的表達以量化可能對腫瘤抗原特異性的T細胞；評估腫瘤反應性CXCL13+ Tex TILs水平已越來越多地被用作許多具有高腫瘤突變負擔的實體腫瘤的預測指標，因為它與免疫治療后預后的改善有關。
圖2. 具有抗腫瘤活性TCR配體鑒定方法列表
相對較少的研究關注在CD4+T細胞上，但圖2中單細胞測序和TIL反應性篩選的廣泛研究表明它們對TIL中的私有新抗原和TAA具有特異性。有個疑問是，CD4+T細胞是否能識別腫瘤細胞，因為腫瘤細胞表面缺乏HLA II類表達。黑色素瘤體外測量TCR對自體腫瘤的反應性揭示了CD4+ TILs與癌細胞之間不同的相互作用模式，CD4+ T細胞可以通過APC激活，也可以直接識別腫瘤細胞殺傷，映射為TME中的PD1+ CXCL13+ Tex細胞簇，并顯示細胞毒性（表達IFNγ和顆粒酶A）。在同時具備TME炎癥的情況下比較明顯的，CD4+ T細胞在HLA II類表達異常的黑色素瘤亞群中的直接激活。雖然腫瘤特異性Treg細胞TCRs可以被癌細胞刺激，目前尚不清楚腫瘤細胞是否可以誘導具有免疫抑制功能的CD4+ TILs，或者更有可能是通過抗原模仿作用于已有的Treg細胞。未來的研究將需要評估腫瘤特異性Treg細胞如何在TME內外分化。
基于T細胞的免疫療法
T細胞免疫療法主要是利用抗腫瘤T細胞的不同特性來增強T細胞功能以達到殺死腫瘤細胞的目的，包括TIL療法、免疫檢查點抑制劑（ICB）、癌癥疫苗和過繼性細胞療法等。其中TIL療法是靶向TME中已存在的抗腫瘤T細胞，在體外對其擴增后再重新高劑量輸回體內，使得抗腫瘤反應在腫瘤外部位（淋巴結、外周血、正常組織）得以擴大。ICB主要是重新激活TME中的抗腫瘤T細胞，釋放更多的趨化因子和細胞因子，而細胞因子的釋放有利于T細胞從腫瘤外的部位募集，增強抗腫瘤反應。TIL和ICB都是靶向已存在的抗腫瘤T細胞，而癌癥疫苗和過繼性細胞療法有所不同，它們是產生新的抗腫瘤特異性T細胞。癌癥疫苗可以誘導抗原提呈細胞介導的抗原未經歷T細胞的啟動，過繼細胞療法是直接在體外對T細胞進行改造，在細胞表面插入天然T細胞受體（TCR）或嵌合抗原受體（CARs）直接對腫瘤細胞進行殺傷。免疫療法誘導的有效抗腫瘤T細胞可以溶解腫瘤細胞，從而促進釋放額外的腫瘤抗原（epitope spreading），這些抗原可以由抗原呈遞細胞呈遞。epitope spreading可以進一步促進先前存在的反應的擴增和重新激活，以及誘導新的T細胞特異性。
圖3.不同T細胞免疫療法作用方式對比
免疫檢查點抑制劑（ICB）
ICB是實體瘤中最被廣泛應用的免疫療法，其中基于靶點PD1、CTLA4、LAG3已被FDA批準用于各類實體瘤的治療，雖然已證明其有效性，但只在少部分患者中達到持續或完全緩解。因此有必要在治療前、治療期間或治療后對活檢組織或外周血中T細胞進行克隆跟蹤，以了解ICB對T細胞組成和功能的影響。
ICB治療的完全或部分應答與原生腫瘤微環境（TME）內不同的T細胞組成以及瘤外部位（外周血、正常組織和引流淋巴結）更廣泛的T細胞庫有關。根據腫瘤類型、分析時間和臨床環境，應答者可以表現為腫瘤內組織駐留記憶T細胞樣耗竭T細胞（Trm-like Tex）的高頻率，具有高細胞毒性，原始耗竭T （Tpe）細胞的增加，具有高再生能力，或腫瘤外部位假定的腫瘤反應性T細胞的擴張和浸潤增加，這些特征被認為是對ICB反應的機制基礎。相反缺乏這樣的T細胞群，因此，末端耗竭T （Tte）細胞的頻率很高，不能實質性地重新激活，使患者容易產生無效的免疫治療反應。
患者經過ICB治療后，首先通過破壞免疫抑制作用，ICB抗體可以釋放抗腫瘤Trm-like Tex細胞的細胞毒活性，這些細胞可以在TME內進一步擴大。這種機制，即所謂的“細胞毒性恢復”，在頭頸部鱗狀細胞癌和乳腺癌的新輔助ICB治療（2-4周）后早期觀察到。其次，ICB具有全身性作用，有利于腫瘤外部位的新（或以前未檢測到的）T細胞特異性的腫瘤內浸潤。新招募的T細胞克隆可能在ICB抗體存在的情況下產生抗腫瘤反應，這可能會阻止細胞毒性的抑制。這種“克隆替代”最初是在基底細胞癌和鱗狀細胞癌患者治療后9周的中位時間出現的。在一些臨床環境和癌癥類型中，這些T細胞庫的系統動力學已被觀察到作為治療后早期（2-4周）反應的預測。最后，應答可以通過祖細胞或早期功能失調的腫瘤特異性T細胞（Tpe細胞）在TME內擴增和分化或從淋巴結和外周組織募集來維持。這已經在肺癌和黑色素瘤病變中觀察到，其特征是治療后晚期（1 ~ 2個月）Tpe細胞的積累。這種現象被稱為“克隆恢復”，因為它的特點是功能失調程度較低的細胞的積累，在ICB介導的抑制信號破壞存在的情況下，這些細胞有可能再生出具有腫瘤細胞毒性的效應細胞的后代。應該強調的是，上述對ICB的反應機制不是相互排斥的，而是可以代表在治療后不同時間階段發生的互補甚至協同的事件。
圖4.ICB治療前后T細胞組成和功能分析
癌癥疫苗
癌癥疫苗通過選擇性地富集T細胞對預先定義的腫瘤抗原的反應性來促進抗腫瘤反應的重新激活和激發，通過增加APC介導的癌癥抗原的呈遞，疫苗接種既可以增強預先存在的腫瘤反應，也可以啟動T細胞前體的新生分化，“引導”抗腫瘤免疫反應的特異性，使其針對特定的免疫原性抗原。不同的癌癥疫苗，其活性成分不同，包括靶向腫瘤抗原的類型、配方、免疫佐劑和遞送載體等。一些研究通過追蹤循環T細胞對目標抗原的反應性，調查了癌癥疫苗如何影響T細胞庫。從這些研究中發現，高達60-70%的預測新抗原能夠誘導反應性T細胞。有趣的是，雖然疫苗接種方案旨在誘導CD8+ T細胞，但應答主要由多克隆CD4+ T細胞組成，這可能是APCs HLA II類分子上長免疫抗原的加工和呈遞所支持的。
通過單細胞測序和多參數流式細胞術分析，最近在8例黑色素瘤患者中完成了一種癌癥疫苗誘導的新抗原特異性CD4+ T細胞的詳細表征。疫苗反應性T細胞在接種疫苗后的頭幾個月擴大，并在接受治療的患者中持續4年。在接種疫苗后的早期階段，針對新抗原的CD4+ T細胞表現出具有激活和衰竭特征的細胞毒性譜；在治療后收集的腫瘤病變中檢測到它們的TCR，證明了這些細胞能夠在TME內運輸。在較晚的時間點（接種疫苗后5年），擁有相同克隆型的T細胞表現出記憶表型，至少在循環中是這樣。
過繼性細胞療法
過繼性T細胞療法（ACT）旨在定量和定性地增強抗腫瘤免疫，這可以通過兩種方式實現：1）擴大體內已有的抗腫瘤特異性T細胞（TIL治療）；2）通過使用抗腫瘤TCR或嵌合抗原受體（CARs）進行基因操作來重定向體內T細胞的特異性，這可以刺激新生抗腫瘤反應。
Rosenberg小組的開創性研究首先證明了從手術切除的腫瘤碎片中分離的TIL如何在體外擴增，篩選對自體腫瘤細胞的識別，然后再輸注到患者體內，這種過繼性TIL治療方法的研究最初達到了約20%的完全臨床反應。TIL治療的一個主要優勢是其多克隆性：對輸注TIL不同批次的分析一致表明，TIL產品含有廣譜的T細胞特異性，包括TAA、新抗原和癌病毒蛋白。雖然TIL治療是ACT發展的一個里程碑，但它受到腫瘤內預先存在的抗腫瘤T細胞數量要求的限制，其數量可能不足以滿足所有患者，特別是在腫瘤突變負擔較低的腫瘤類型的背景下，例如黑色素瘤。為了克服這一限制，許多研究小組已經將重點放在基因操作上，以工程TCR或CAR的形式重新定向T細胞對腫瘤抗原的特異性。
使用經過基因工程改造的T細胞來表達腫瘤特異性TCRs，需要對TCRs進行分離、測序和驗證，這些TCRs能夠在給定患者的HLA背景下識別腫瘤抗原。因此，這種方法受到了一定的限制，部分原因是由于HLA的高頻率限制導致難以找到針對公共TAAs的高親和力TCR。當ACT方法使用針對TAAs的特異性TCR時，由于其在健康組織上的表達可能較低，因此需要進行廣泛的臨床前測試。通過測序和分離新抗原特異性TCRs來鑒定腫瘤特異性突變，為克服這一障礙提供了一種潛在的解決方案。
CARs的出現徹底改變了ACT領域，因為這樣的結構使得靶向表面腫瘤蛋白以一種不依賴于HLA的方式進行。CAR通常需要數千個靶表面分子來介導有效的反應，只有在確定腫瘤細胞上具有高、廣泛和保守表達的表面蛋白時才可行。這對實體瘤來說是具有挑戰性的，因為它們具有很高的瘤內克隆異質性和免疫抑制潛力；然而在神經母細胞瘤和肉瘤中使用CAR特異性的雙神經節脂苷GD2和人表皮生長因子受體2 （HER2）獲得了令人鼓舞的結果。相反地，CART細胞在治療血液腫瘤方面表現出顯著的成功，主要針對表達CD19、CD20、CD22的B細胞急性或慢性血液腫瘤。 CAR-重定向T細胞是一種合成分子，在提供抗原識別的同時，通過一個或多個共刺激內結構域（這可能取決于特定的CAR結構設計）進行非生理性的順式共刺激;對于CD19 CAR，即使在清除腫瘤細胞后，正常B細胞上也有可能通過識別CD19而產生本構性強直CAR信號傳導，臨床表現為B細胞發育不全延長。
過繼T細胞的表型組成影響治療結果，具有抗腫瘤潛能的輸注T細胞的質量是促進其體內持久性和轉移到癌癥患者后的功能的主要因素。抗腫瘤T細胞可以從腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）或外周血單核細胞（PBMCs）中擴增出來，并且可以通過引入天然T細胞受體（TCR）或嵌合抗原受體（CARs）來進一步操縱它們，使其特異性轉向腫瘤抗原。這種T細胞的體外激活導致具有多種表型的T細胞擴增，一旦T細胞轉移到癌癥患者體內，就會影響其動力學和功能。輸注產品富含再生潛力低的衰竭T （Tex）細胞表型（終末衰竭T （Tte）細胞和組織常駐記憶細胞樣耗竭細胞（Trm-like Tex），只能提供短期的抗腫瘤功能，在體內迅速下降，因此對癌細胞的控制有限。事實上，在接受過繼性T細胞療法（ACT）治療的患者中，輸注的Tex細胞克隆在輸注后（2-4周）早期收縮，由此產生的抗腫瘤T細胞的低持久性與疾病進展或復發有關。相反，富含記憶T （Tmem）細胞的T細胞產物與轉移的抗腫瘤T細胞的高水平持久性有關，進而與對ACT的反應有關。輸注T細胞更好的適應性來自于具有再生潛力的細胞（Tmem細胞）的存在，或者在有限程度上來自于原始耗竭祖細胞（Tpe）細胞的存在，這些細胞可以在體內擴增、長期存在并分化產生大量的效應物，從而成功地控制腫瘤。因此，ACT可以從有利于非耗盡抗腫瘤T細胞的體外生成和擴增的方法中受益。
圖5. 過繼T細胞表型影響治療療效
總之，體外構造T細胞療法如果富集了具有Tmem細胞特征的抗腫瘤T細胞，與體內T細胞持久性和疾病控制有關，而那些富集了抗腫瘤Tex細胞的方案在注入患者體內后，T細胞適應性就很差。
總結
隨著單細胞轉錄組、單細胞TCR-seq、空間轉錄組及空間蛋白組等技術的發展及其在從癌癥生物標本中表征T細胞庫特性方面的應用，使得對患者和臨床前模型中抗腫瘤T細胞的細胞狀態的解剖成為可能。通過縱向追蹤患者的這種T細胞特異性，我們可以更好地了解與產生生產性抗腫瘤反應相關的動力學。在免疫熱腫瘤中，癌癥的生長伴隨著具有多種抗腫瘤潛力的耗竭T細胞的誘導，成功的腫瘤控制需要這些功能的重新激活和/或重新布線。隨著T細胞分析技術的不斷進步及其在人類樣本中的應用，我們可以更好地理解成功免疫療法背后的生物學事件，并將這些發現轉化為新的治療選擇，以促進所有癌癥患者的抗腫瘤T細胞免疫。
