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本月中山大學陳明遠教授在nature communications（IF：17.694）發(fā)表了研究論文，該研究探索了與鼻咽癌(NPC)轉移相關的因素。對163個匹配的血液和原發(fā)性、區(qū)域淋巴結轉移和遠處轉移腫瘤樣本進行了整合基因組分析，并結合了來自兩名患者的11個樣本的單細胞RNA-seq。研究了轉移性腫瘤與原發(fā)性和區(qū)域性淋巴結腫瘤異同。進而研究了轉移的不同途徑及其特點。
鼻咽癌(NPC)起源于鼻咽上皮，在東南亞最常見，中國廣東廣東人的發(fā)病率最高。臨床試驗表明，化療加大劑量局部放療可以提高新生轉移性鼻咽癌患者的總生存率(OS)。此外，局部放療還減少了遠處轉移性復發(fā)。然而，63例患者中有17例在局部放療結束后未達到客觀緩解(完全或部分緩解)。因此，揭示促進這種協(xié)同作用的機制，并篩選適合高強度局部放療的患者是至關重要的。大規(guī)模的基因組和轉錄組測序研究揭示了鼻咽癌樣本的突變格局和不同的亞型。但目前沒有對轉移鼻咽癌的基因組結構做出定義，進而識別轉移的時間或空間模式。
首先，從44名鼻咽癌患者中獲得了167個腫瘤樣本(83個原發(fā)病灶、44個區(qū)域淋巴結病變和40個轉移病灶)和35個匹配的血液樣本(圖1a)。并對這些樣本進行全外顯子組/全基因組測序(WES/WGS)、RNA-seq、scRNA-seq(圖1b)。轉移性腫瘤樣本具有與原發(fā)性和區(qū)域性淋巴結腫瘤相似的非沉默突變負荷(圖2a)。原發(fā)性、區(qū)域性淋巴結和轉移性腫瘤的主要替代類型是C > T轉移，這也是不同鼻咽癌病理亞型報告的主要特征(圖2b)。使用非負矩陣分解，在所有樣本中識別出5個穩(wěn)健突變signature，并根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)庫將5個突變標記被注釋為2、4、5、6和13 signature(圖2c-e)。總的來說，不同的樣本有不同的顯性突變特征，但AID/APOBEC相關的特征，包括Signature 13和Signature 2，是所有樣本中貢獻最大的兩個特征，轉移性腫瘤樣本的突變譜的總體模式與原發(fā)性和區(qū)域性淋巴結腫瘤樣本的突變譜相似(圖2f)。Signature 6在轉移性腫瘤中的主導地位進一步表明，缺陷DNA錯配修復可能對NPC的進展產生廣泛而重要的影響(圖2d，e)。
為了評估鼻咽癌中的瘤內異質性（ITH），作者重建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3a，b)。平均而言，在原發(fā)和區(qū)域淋巴結腫瘤中，分別只有20.79%和22.29%的突變表現(xiàn)為所有區(qū)域共有的主干突變。這說明原發(fā)性和區(qū)域性淋巴結腫瘤中存在大量高ITH。此外，通過根據(jù)癌細胞分數(shù)(CCF)將體細胞變異分為克隆和亞克隆突變，轉移性腫瘤中亞克隆突變的比例與原發(fā)和區(qū)域淋巴結中的相當(圖3c)。亞克隆突變在原發(fā)腫瘤中的比例與區(qū)域淋巴結/遠處轉移腫瘤中的比例呈正相關(圖3d)。作者還采用MATH評分來評估腫瘤的ITH，結果顯示，原發(fā)性、區(qū)域淋巴結和轉移性腫瘤的ITH相似（圖3e，f)。這些結果表明鼻咽癌具有較高的ITH，區(qū)域淋巴結和轉移性腫瘤可能繼承了這一特征。
然后，使用MutSigCV分別鑒定原發(fā)、區(qū)域淋巴結和遠處轉移腫瘤中的顯著突變基因(SMGs)。除了在之前報道中提到的頻繁突變的基因，還發(fā)現(xiàn)了其他SMGs，如SIX2和RPLP1(圖1c)。生成了31個“driver genes”的組合列表(圖1c)。雖然大多數(shù)驅動基因在三個位點的突變頻率高度相似，但SIX2和NOTCH2在轉移性腫瘤樣本中的突變頻率明顯高于原發(fā)腫瘤樣本(圖1c)，提示SIX2和NOTCH2可能在鼻咽癌轉移中發(fā)揮重要作用。（SIX2是一種發(fā)育轉錄因子，通過上皮-間充質轉化(EMT)途徑或誘導癌癥干細胞程序促進乳腺癌轉移。NOTCH2是一種新發(fā)現(xiàn)的癌基因，通常在一系列癌癥中過度表達，可促進膀胱癌的腫瘤生長和轉移。）
通過GISTIC算法使用WES數(shù)據(jù)獲得體細胞拷貝數(shù)改變(SCNAs)。并根據(jù)GISTIC2獲得了“擴增(AMP)”和“缺失(DEL)”改變(圖1d)。與原發(fā)腫瘤相比，區(qū)域淋巴結或遠處轉移腫瘤中未檢測到明顯差異的SCNAs。先前報道的眾所周知的9p21.3 (CDKN2A)、3p21.31 (RASSF1)等拷貝數(shù)缺失和11q13.3 (CCND1)、3q26.1 (PIK3CA)等擴增在所有三個位點均普遍存在。盡管在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)了高ITH，但原發(fā)性、區(qū)域性淋巴結和遠處轉移性腫瘤的基本基因組特征是相似的。
為了研究鼻咽癌轉移過程中選擇的驅動事件，作者系統(tǒng)地描述了每種變體的克隆性以及基于變體CCFs的轉移性鼻咽癌的腫瘤亞克隆結構。在轉移過程中，根據(jù)原發(fā)腫瘤和轉移腫瘤之間的克隆性動態(tài)變化，11,148個變體被分為四組(圖4a)：
NFKBIA、TET2、BAP1、TP53和FAT1等驅動基因存在體細胞突變的克隆在轉移中明顯“selected”(圖4a)。此外，所選組的體細胞突變在EMT、有絲分裂紡錘體、根尖連接、炎癥反應和E2F靶標等癌癥轉移相關通路中顯著富集(圖4b)。
據(jù)報道，大約20%-30%的鼻咽癌患者在標準放化療后會發(fā)生遠處轉移。
在治療后轉移性腫瘤中持續(xù)存在的克隆變異可能不僅與治療耐藥性有關，還可能與腫瘤轉移有關。首先，如KRAS擴增、JAK2擴增、CADM1缺失和NFKBIA缺失，在殘余原發(fā)腫瘤中是克隆的，但在預處理原發(fā)腫瘤中是亞克隆的或無法檢測到的，這表明這些事件可能與治療耐藥性和進一步的轉移進展有關(圖4d)。（KRAS已知在各種癌癥類型中賦予化療耐藥；NFKBIA是NF-κB通路的知名負調控因子，據(jù)報道可增強鼻咽癌的化療耐藥性。）其次，TP53、ARID1A和TRAF3等基因中的SNVs和ATG13缺失、KMT2D擴增和ARID1A缺失等CNVs在治療后進展性轉移腫瘤中明顯“selected”(圖2e)。除EP300擴增、FBXW7缺失和PTEN缺失外，大多數(shù)在治療后轉移瘤中“selected”CNVs也被發(fā)現(xiàn)在預處理轉移樣本中“selected”(圖4c，e)。（EP300是食管癌鱗狀上皮癌中最重要的基因，通過下調FBXW749來改變腫瘤相關巨噬細胞的極化，從而促進彌漫性大b細胞淋巴瘤的腫瘤進展。FBXW749是一種關鍵的腫瘤抑制因子，在超過30%的人類癌癥中被刪除。）EP300擴增和FBXW7缺失可能對鼻咽癌轉移的進展有協(xié)同作用。此外，在殘留原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的所有“selected”變異在治療前和治療后的轉移樣本中也“selected”，這證明這些變異不是由治療引起的，可能在引發(fā)遠處轉移中起著至關重要的作用。
作者進一步檢查了治療后主要殘留樣本患者(P27, P31和P32)的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構。發(fā)現(xiàn)治療前的進展性轉移樣本和原發(fā)樣本聚類在同一分支中，表明治療后的進展性轉移病灶與治療前的原發(fā)病灶相關，可能源于治療前的原發(fā)病灶克隆。相比之下，進展性轉移樣本和治療后原發(fā)性殘留樣本在P32中聚類為同一支，表明進展性轉移可能源于治療后原發(fā)性殘留病灶的克隆(圖4f)。根據(jù)P32的系統(tǒng)發(fā)育樹，在進展性轉移樣本和治療后殘留的原發(fā)腫瘤樣本中都存在克隆性NFKBIA缺失，但在預處理原發(fā)腫瘤中不存在；克隆性ARID1A缺失僅在進展性轉移中被檢測到(圖4g)。這表明NKFBIA缺失和ARID1A缺失可能導致了P32的治療耐藥性，并進一步引發(fā)了遠處轉移。
根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構，作者識別了兩種轉移的進化途徑：
采用bootstrapping策略來評估每個轉移的轉移途徑的概率。從兩名患者(P05和P06)中篩選出了不符合概率臨界值(0.75)的兩個轉移瘤，從8名患者中篩選出了11個經(jīng)淋巴途徑播撒的轉移性瘤；5名患者中有8個通過血行途徑傳播的轉移性瘤(圖5b)。
基于突變CCF的亞克隆進化分析進一步證實了該發(fā)現(xiàn)。淋巴途徑的轉移性腫瘤與區(qū)域性淋巴結腫瘤共享至少一個私有亞克隆，而血液途徑的轉移性腫瘤與區(qū)域性淋巴結腫瘤不共享任何亞克隆(圖5c)。相比之下，P04的轉移瘤(甲狀腺)血源性進化模型起源于原發(fā)腫瘤。P04的遠處轉移性和區(qū)域淋巴結腫瘤沒有聚集到系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支中，也沒有共享任何私有亞克隆(圖5d)。總體而言，除P14-Met3和P01-Met外，89.47%的遠處轉移病灶的進化路線通過亞克隆進化分析得到驗證。
來自同一病人的不同轉移性腫瘤傾向于遵循相同的進化路線。P07的肝和肺轉移是從區(qū)域淋巴結演化而來的，P14的所有轉移腫瘤(肝、骨和腹股溝淋巴結)也都是從區(qū)域淋巴結腫瘤演化而來的(圖5e，f)。同樣，P15的所有遠處轉移性腫瘤(多個腋窩淋巴結)都來自原發(fā)腫瘤(圖5g)。
進一步對來自淋巴(P14)和血行(P15)轉移患者的匹配的原發(fā)性、區(qū)域性淋巴結和遠處轉移性腫瘤進行了scRNA-seq，得到了53913個細胞(圖6a-c)。繪制樣本來源的細胞，通過Monocle2觀察到連續(xù)的腫瘤進化軌跡(圖6d-e)。有趣的是，原發(fā)腫瘤細胞首先遷移到區(qū)域淋巴結，然后按照不同的路線擴散到骨和腹股溝淋巴結或肝臟，這與利用基因組數(shù)據(jù)構建的系統(tǒng)發(fā)育樹揭示的淋巴進化路線密切一致(圖6d)。相比之下，來自原發(fā)和轉移部位的惡性細胞混合，在P15中沒有發(fā)現(xiàn)與樣本來源相關的明確進化路線，這可能是由于腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤直接擴散到區(qū)域淋巴結或由系統(tǒng)發(fā)育樹揭示的遠處轉移(圖6e)。
接下來，作者研究了這兩種途徑是否具有不同的基因組特征。突變signature 6(DNA錯配修復相關)在血行途徑中顯著富集(圖7a)。通過淋巴途徑轉移瘤比血行途徑的轉移瘤具有明顯更多的“selected”突變(圖7b)。
bulk RNA-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，淋巴途徑的原發(fā)腫瘤在EMT、UV反應和血管生成等途徑中顯著富集，而血行途徑的原發(fā)腫瘤在IFN-α和IFN-γ反應途徑中顯著富集(圖7c，d)。假設血行途徑原發(fā)腫瘤的免疫微環(huán)境中應該存在更多的耗竭T細胞，這有利于腫瘤細胞的擴散。重新聚集P14和P15原發(fā)腫瘤的免疫細胞。發(fā)現(xiàn)P14(淋巴途徑)和P15(血行途徑)的腫瘤免疫微環(huán)境有顯著差異。CD8+ T細胞在P14(淋巴途徑)中顯著升高。CD8+ T細胞進一步聚成8個亞簇，并提取每個亞簇的標記(圖7e，f)。細胞毒性降低的C7_CXCL13高表達耗盡標記物在P15(血行途徑)中顯著豐富（圖7g）。進一步通過標記物CXCL13、TIM3和CD8的多重免疫組化(IHC)染色驗證了該結果(圖7h)。由于免疫檢查點抑制劑(ICIs)可以重新激活耗盡的T細胞，因此有理由假設C7_CXCL13的富集可能表明對免疫治療有良好的反應。為了確定高表達CXCL13的耗竭CD8+ T細胞的富集是否與免疫檢查點封鎖(ICB)更好的療效相關，作者收集了兩個公開scRNA-seq數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)在膀胱細胞癌(BCC)和透明細胞腎細胞癌(ccRCC)中，衰竭的CD8+ T細胞在對ICB敏感的患者中比在對ICB耐藥的患者中更普遍。這些線索表明，通過血行途徑轉移的鼻咽癌患者可能對免疫治療產生良好的反應。
經(jīng)血行途徑轉移的患者原發(fā)病灶較大，但區(qū)域淋巴結較低區(qū)域受累較少，骨轉移病灶較少(圖8a-c)，如圖P01淋巴途徑(圖8d)和P03血行途徑(圖8e)所示。作者提取原發(fā)腫瘤的圖像特征，然后建立一個基于機器學習的預測模型，以13例具有基因組證據(jù)的患者的放射組學數(shù)據(jù)為訓練數(shù)據(jù)集，從血行途徑中識別淋巴路徑;該模型獲得了1.0的高準確率和1.0的AUC(圖8f)。此外，將放射組學預測模型應用于治療前沒有完全配對的原發(fā)性、區(qū)域性淋巴結和轉移性腫瘤樣本的患者。對于P25和P27，放射組學預測模型的結果與基因組證據(jù)相一致(圖8g)。此外，通過放射組學模型預測的血行途徑的原發(fā)腫瘤比淋巴途徑具有更高的IFN-α和IFN-γ反應途徑活性(圖8h)，這與先前基于具有基因組證據(jù)的樣本的結果一致。
為了驗證放射組學預測模型的準確性，作者收集了額外匹配的原發(fā)性、區(qū)域性淋巴結和轉移性腫瘤(P49-P53)，然后利用放射組學預測模型構建基因組系統(tǒng)發(fā)育樹并同步預測轉移路徑，結果表明基于基因組數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育樹與放射組學預測結果一致(圖8i)。然后，將放射組學預測模型應用于更大的臨床隊列，包括從頭轉移性鼻咽癌隊列和免疫治療隊列。臨床隊列中淋巴和血行途徑的影像學特征與訓練數(shù)據(jù)集一致。由于臨床診斷的患者大多處于M0期，最終可能發(fā)生轉移，因此盡早預測轉移路徑并實施特定的治療方式將會有很大幫助。因此，將預測模型應用于M0期鼻咽癌隊列，發(fā)現(xiàn)血行組原發(fā)腫瘤的大小更大，下頸部淋巴結的數(shù)量比淋巴組更少。這些結果表明，放射組學預測模型可以對淋巴和血行途徑進行分類。
在13例有基因組證據(jù)的鼻咽癌轉移患者中，5例血行轉移患者的無進展生存期(PFS)長于8例淋巴轉移患者(圖9a)。在招募的104例新生轉移性鼻咽癌隊列中，26例通過血行轉移途徑轉移的患者的2年PFS時間明顯長于78例通過淋巴途徑轉移的患者(圖9b)。
在104例轉移性鼻咽癌患者隊列中，治療結束評估轉移病灶時，局部區(qū)域放療與淋巴轉移途徑患者的客觀緩解率(ORR)顯著高于不進行局部區(qū)域放療。相比之下，對于經(jīng)血行途徑轉移的患者，局部區(qū)域治療與不進行局部區(qū)域放射治療相比，ORR沒有顯著提高(圖9c)。此外，淋巴轉移途徑的患者治療中加入局部區(qū)域放療可改善疾病控制，而血行轉移途徑的患者沒有明顯受益于聯(lián)合局部區(qū)域放療(圖9e，f)。
此外，在66例接受托利帕單抗、阿帕替尼和吉西他濱聯(lián)合免疫治療的免疫治療隊列中，14例血行組患者的ORR顯著高于52例淋巴組患者(圖9d)。這些發(fā)現(xiàn)表明，淋巴和血行轉移途徑可能有效地對疾病進展高風險的患者進行分層，并可能用于選擇特定患者進行局部區(qū)域放療或免疫治療。
在這項工作中，作者收集了配對的鼻咽癌原發(fā)和轉移性腫瘤樣本，并進行了基因組和轉錄組測序，包括scRNA-seq，來追蹤鼻咽癌遠處轉移的進化歷史。通過對成對的原發(fā)和轉移性鼻咽癌的大規(guī)模bulk和單細胞測序數(shù)據(jù)的綜合分析，可以更好地了解鼻咽癌轉移的進化史以及局部區(qū)域治療對轉移性鼻咽癌影響的機制。該研究為鼻咽癌轉移的進化軌跡和特征提供了廣泛的見解。描繪了鼻咽癌原發(fā)、區(qū)域淋巴結和轉移性腫瘤的全面基因組圖景。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析和scRNA-seq分析，觀察到兩種不同的遠處轉移的傳播途徑，包括區(qū)域淋巴結轉移的淋巴傳播和原發(fā)腫瘤的血行傳播。通過淋巴途徑的原發(fā)腫瘤在EMT、UV反應和血管生成等途徑上顯著富集，而通過血行途徑的原發(fā)腫瘤在IFN-α和IFN-γ反應途徑上顯著富集。并成功地利用放射組學數(shù)據(jù)將鼻咽癌轉移途徑分為淋巴轉移和血行轉移。最后，在淋巴轉移途徑患者的治療中加入局部區(qū)域放療可改善生存結局，而血行途徑患者則更多地受益于免疫治療。
