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各位小伙伴們大家好呀，癌癥研究大家可能已經見多識廣啦。今天小編給大家帶來發表在Cell Discovery(IF=38.079)上的一篇關于癌癥并發癥的單細胞研究。作者對于癌癥相關惡病質這一臨床問題通過單細胞和實驗進行了詳細的剖析，快來和小編一起看看吧！
一.研究背景
癌癥相關惡病質(cancer-associated cachexia,CAC)是一種病因復雜的綜合征，其特征是骨骼肌和脂肪組織的顯著耗竭。CAC患者通常表現為食物攝入減少、能量消耗升高、分解代謝過剩和系統性炎癥。CAC的發生會增加患者死亡率并降低生活質量以及放療化療的療效。
白色脂肪組織(white adipose tissues,WAT)由不同的細胞成分組成。除脂肪細胞和脂肪干祖細胞(ASPCs)外，WAT中還存在內皮細胞、平滑肌細胞以及多種類型的常駐和浸潤的免疫細胞。總之，這些細胞調節脂肪微環境，并在代謝紊亂的發生發展中起重要作用。于是作者通過分析來自有或沒有CAC的個體的內臟和皮下庫的人脂肪組織的單細胞表達譜，描述了與惡病質發展相關的不同細胞類型和/或不同儲存庫的特異性，揭示了對惡病質的儲存庫特異性和疾病特異性細胞反應以及導致CAC脂肪組織消耗的細胞免疫反應改變。
二.主要結果
1.脂肪組織中非脂肪細胞部分細胞群的鑒定
作者對8例胃癌患者(4例非惡病質、4例惡病質)的SAT和VAT脂肪樣本的間質血管組分(SVFs)進行了單細胞RNA測序(scRNA- seq)。經過質量控制，最終保留33856個細胞進行下游分析；經過聚類及標記基因注釋(圖1b)分為9個主要的細胞群(圖1a)。作者觀察到：惡病質組和非惡病質組不同細胞類型的分布在VAT和SAT上無明顯差異；但是，VAT和SAT不同細胞類型的百分比有明顯的差異，VAT中有更多的免疫浸潤(圖1c、d)；SAT中含有較多的血管細胞，與觀察到的SAT血管化良好一致。CAC患者SVF中免疫細胞比例明顯高于VAT(圖1d)。
2.在VAT和SAT中鑒定出不同的祖細胞群
在這一部分，作者對VAT和SAT中的祖細胞群進行了詳細分析。經過分析，作者將脂肪干細胞和祖細胞(adipose stem and progenitor cells, ASPCs)聚類為12簇，每一簇均表達高水平的CD34、FDGFRA和THY1(圖2a)。表達高水平MGP、CXCL14、APOD被注釋為成脂祖細胞；高表達FMO2基因的簇主要分布在VAT中，因此被標記為內臟前脂肪細胞(vPreA)；高表達FABP4和APOE的簇表明更傾向于成為成熟的脂肪細胞，被標記為皮下前脂肪細胞(sPreA)；除此之外，作者還注釋發現了成纖維細胞、造血干細胞(HSC)以及炎癥祖細胞(inflammatory progenitor cells)（圖2a）。
對SAT中脂肪生成祖細胞的軌跡分析發現了兩種不同的轉變，即從ASC開始向sPreA或vPreA和成纖維細胞的轉變，這表明了sPreA和vPreA在脂肪生成中的內在區別是由分叉的發育軌跡決定的(圖2b)。然后，作者通過GO分析顯示，與VAT相比，SAT的前脂肪細胞線粒體功能和脂肪酸代謝增強(圖2c)。通路富集分析也顯示，SAT中PPAR信號通路活性較高，表現為FABP4、FABP5、ANGPTl4、LPL和CD36的表達相對較高，與SAT中大多數祖細胞為前脂肪細胞的觀察結果一致(圖2d、e)。
3.SAT和VAT中脂肪祖細胞的惡病質特異性改變
作者進一步分析了惡病質和非惡病質患者在不同脂肪儲存庫(SAT和VAT)中可能的祖細胞變化(圖3a)。作者觀察到，與無惡病質的患者相比，在惡病質組的vPreA中，主要調節脂肪細胞分化的基因，包括CEBPB,CEBPD,BMP2和KLF4明顯降低(圖3b、c)。此外，簇10被標記為ITLN1和MSLN特異性表達的間皮源性祖細胞，幾乎只在非惡病質患者的VAT中發現(圖3d)。作者進一步對簇8(也被稱為炎癥祖細胞)中上調的基因進行功能分析發現，趨化因子信號通路、NOD樣受體信號通路、補體和凝血級聯顯著富集，提示炎癥反應被激活(圖3e)。
作者假設SAT中惡病質特異性炎癥祖細胞的發生可能是由腫瘤衍生因子引起的，通過scRNA-seq數據鑒定的標記基因，包括CCL2,CXCL2,TNFAIP6和TNFRSF12A表明腫瘤細胞將脂肪生成祖細胞轉化為炎癥祖細胞，證明其假設。進一步，作者通過細胞系實驗也得到了相同的結論(圖3f)。這些結果表明，腫瘤細胞分泌的某些蛋白質至少部分地促進了祖細胞中活化的趨化因子基因表達，特別是在惡病質患者中。
4.巨噬細胞在惡病質患者中表現為促炎轉變，并可能加重脂肪消耗
髓系細胞對惡病質的影響仍不確定。因此，作者對脂肪組織中的巨噬細胞進行了詳細的分析。基于巨噬細胞的marker基因，作者鑒定了三種具有獨特高表達基因的不同亞型，并推斷了它們潛在的病理生理功能：存在于各種組織中，高表達LYVE1、SELENOP以及CD163的血管周圍巨噬細胞(PVM)；特征為MHC-Ⅱ的高表達和低表達LYVE1類似于巨噬細胞的一種亞型，作者定義為非血管周圍巨噬細胞(NPVM)；以及主要在VAT中檢測到的脂質相關巨噬細胞(LAM)。
作者發現CAC組兩庫(SAT和VAT)的脂肪組織巨噬細胞(ATM)占免疫細胞的比例均降低(圖4a)。接下來通過結腸腺癌小鼠模型作者發現，在惡病質條件下，VAT中巨噬細胞的比例明顯下降，而SAT中巨噬細胞的比例沒有下降，與scRNA測序結果一致(圖4b)；此外，作者還發現附睪WAT(epididymal white adipose tissues,eWAT)的重量與脂肪組織中巨噬細胞的豐度呈正相關(圖4c)。如圖4d所示，脂代謝相關基因，如CEBPD和ACSL1，在無CAC患者的巨噬細胞中表達上調的基因中富集。進一步的實驗分析表明，在CAC發展過程中，巨噬細胞清除后，eWAT的體重下降顯著減少，脂肪組織重量更重，脂肪細胞更大(圖4e-i)。此外，在氯磷酸二鈉脂質體處理的小鼠脂肪組織中，脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的表達和激素敏感性脂肪酶(HSL)的磷酸化均降低，這表明在eWAT中脂肪分解的活化程度較低(圖4j、k)。在這個過程中作者還發現，IFN-γ的mRNA和蛋白表達水平在惡病質發展時增加，在氯磷酸二鈉脂質體處理后恢復到基礎水平(圖4l、m)。最終，作者得出結論：在惡病質發展過程中，VAT中巨噬細胞的促炎轉化可能顯著促進脂肪丟失。
5.CD8+T細胞在惡病質患者的VAT中也表現出促炎特征和增強的細胞溶解效應活性
在這一部分，作者對淋巴系細胞進行分析。脂肪組織中的免疫細胞主要由T/NK細胞組成，作者對T/NK細胞進行了重新聚類注釋(圖5a、b)。如圖5c、d所示，大部分的T細胞都來源于VAT，于是作者重點關注了CAC期間VAT中的免疫微環境改變。
接下來，作者使用Monocle推斷狀態軌跡，探索了CD8+T細胞的動態免疫狀態和細胞轉移(圖6a)。具有較高細胞毒性分數的TEMRA出現在軌跡分支的一端，TRM出現在中間狀態，終止于激活的TEM(圖6a)；CAC組的CD8+T細胞出現在較晚的階段(圖6b)，表明其具有活化性質。差異基因表達分析顯示，在惡病質患者中，代表活化狀態的基因表達顯著升高；與非惡病質患者效應記憶性CD8+T細胞比例較高一致，與功能失調表型和失活狀態相關的基因如MT1X、MT1E、IL7R和ZFP36L2在非惡病質患者CD8+T細胞中高表達(圖6c)。
為了進一步證實在CAC發展過程中，更多高細胞毒性的活化CD8+T細胞浸潤到脂肪組織中，作者收集了另外8例接受手術治療的胃癌患者的脂肪組織，通過免疫組織化學染色對GZMB+細胞進行了染色(圖6d)。作者發現染色GZMB+細胞的數量與脂肪細胞的大小有很強的相關性(圖6e)，提示由癌癥相關因素觸發的脂肪組織局部組織分解代謝與細胞毒性T細胞浸潤之間的存在一定的關聯。通過對食管癌或胃癌的bulk RNA-seq數據反卷積分析，作者推斷體重減輕患者的VAT中細胞毒性CD8+T細胞的百分比增加(圖6f)。圖6g顯示，惡病質患者脂肪組織SVF中多種細胞類型的TNF和TNFSF12表達普遍增加，而這些SVF細胞中IL6或IL1B的表達沒有顯著增加，這表明成熟脂肪細胞可能是主要來源。
體外共培養成熟脂肪細胞和活化的原代CD8+T細胞實驗發現，共培養一天后脂肪細胞中脂滴的大小顯著減少，培養上清液中甘油的濃度增加，表明脂肪的溶脂作用增強(圖6h-j)；脂肪細胞中HSL磷酸化水平也一致升高(圖6k、l)。綜上這些結果，作者提出結論：活化的CD8+T細胞在體外對脂肪細胞具有促進分解代謝的功能；在惡病質發展過程中，活化的CD8+T細胞可能通過產生更多的IFN-γ，促進脂肪分解代謝。
6.細胞相互作用分析預測了惡病質中人類WAT相互作用組的重塑
由于VAT中某些免疫細胞類型的結構和功能表型的顯著變化，作者在這一部分探索激活狀態的這種轉變在多大程度上影響細胞通信。基于CellPhoneDB分析，作者發現：在CAC的的背景下，免疫細胞之間的配體受體對數量較多, 尤其是涉及巨噬細胞的(圖7a)。進一步作者使用Connectome web分析來揭示CAC過程中巨噬細胞的潛在靶細胞，分析顯示巨噬細胞與單核細胞和cDC2Bs具有相似的連通性(圖7b)；進一步作者提取了CAC過程中與CD8+T細胞的高表達相互作用，揭示了與巨噬細胞的潛在相互作用(圖7c)。綜上結果，在惡病質患者的脂肪組織中發生著細胞相互作用的急劇重塑，包括脂肪祖細胞、巨噬細胞、CD8+T細胞等。
至此，這篇文章就介紹完啦。總結起來，這篇文章基于癌癥相關惡病質(CAC)這個臨床上較為嚴重的綜合征，通過對皮下脂肪組織(SAT)和內臟脂肪組織(VAT)的單細胞測序分析以及多種實驗分析，描繪了惡病質發展相關的不同細胞類型和/或不同脂肪儲存庫的特異性以及細胞反應，揭示了導致CAC脂肪組織消耗的細胞免疫反應改變。這為理解CAC的發生以及臨床治療方法的開發提供了幫助。縱觀全篇，生信分析都是基礎的單細胞分析，小編覺得這篇文章最大的亮點在于實驗與生信分析的完美結合以及每個結果對所研究問題的環環相扣，這些非常值得我們學習！
