掃碼聯系客服
開 — 門 — 見 — 山 ~ 今天給大家分享一篇2021年12月發表在Front Cell Dev Biol（Q1，IF=6.684）的文章。
人視網膜色素上皮的單細胞轉錄組圖譜
主要干了啥？
作者通過單細胞RNA測序，確定了兩個在基因表達模式和功能上表現出巨大差異的人類視網膜色素上皮（hRPE）細胞亞群，黃斑視網膜色素上皮（RPE）和外周RPE，與氧化應激和內質網應激相關的基因在黃斑RPE中高度表達，而與光感、氧化應激和脂質代謝相關的基因在外周RPE中更為豐富。作者提供了hRPE中眼部疾病相關基因的圖譜，并強調了黃斑RPE和外周RPE的P4和P6亞群作為視網膜疾病潛在治療靶點的重要性。
詳情來啦
背景和研究動機
在人類和靈長類動物視網膜的后極附近有一個直徑為2.5-3毫米的淺漏斗狀凹陷，稱為黃斑或黃斑。黃斑的中央凹陷稱為中央凹，其中視網膜最薄，只有兩層細胞：RPE和錐體細胞。許多導致失明的眼部疾病，如年齡相關性黃斑變性（AMD），主要影響中央凹，這表明研究視網膜，特別是黃斑的細胞功能具有重要意義。
在單細胞水平上已經有許多研究報道了人類和其他靈長類動物的視網膜細胞亞群，人類RPE細胞的異質性和詳細的分子圖譜尚未得到很好的研究。然后作者認為雖然有許多研究闡述了RPE細胞的重要功能和特性，但尚未在hRPE細胞中區分精確的細胞類型。因此，有必要探索hRPE細胞的異質性和分子圖譜，以闡明hRPE相關視網膜疾病的發病機制，并為這些疾病發現更多的治療方法。
結果
建立hRPE單細胞轉錄組圖譜
在本研究中，作者從三名捐贈者（年齡29-64歲）獲得成人hRPE樣本，構建具有hRPE細胞的單細胞轉錄組圖譜（圖1）。產生高質量細胞圖譜的hRPE細胞圖譜分為兩個群體：一個群體有8863個細胞，另一個群體有439個細胞。兩個群體都表達RPE標記基因，如PAX6和BEST1。先前的轉錄組研究（Voigt等人，doi:10.1073/pnas.1914143116）表明，ID3和IGFBP5分別在hRPE細胞的黃斑區和外周區高度表達。而作者恰巧發現ID3的特異性表達僅限于其中一簇包含少數細胞的群體（439個細胞），而IGFBP5在另一個群體（8863個細胞）中高度富集。因此，作者假定一個簇是黃斑RPE，另一個簇是外周簇。兩者的基因表達不同（三個樣本結果相似），并對這些基因進行Gene Ontology (GO)通路富集分析。外周RPE細胞和黃斑RPE細胞在質子跨膜轉運、內質網應激和ATP代謝過程中可能存在顯著差異。
人黃斑RPE細胞亞群的分析
作者探究了黃斑RPE細胞的異質性，發現根據基因表達譜可將黃斑RPE細胞分為兩個亞群（M1和M2簇）（圖2A、B）。差異表達分析顯示，在三個樣本中，不僅兩個亞群的差異表達基因顯示出相似的表達模式（圖2B-D），而且兩個亞群的統計比例非常相似（圖2E、F）。進一步GO分析表明，M1簇富含細胞粘附和細胞連接，M2簇主要富含疾病或創傷引起的氧化應激和內質網應激（圖2G）。也就是說，黃斑RPE也可分為執行不同功能的較小亞群。
人外周RPE細胞亞群及表達譜
當然，作者也進一步分析了外周RPE細胞群。根據基因表達差異，外周RPE細胞可分為8個亞群。同樣，三個樣本具有相似的基因表達模式和亞群比例。接下來，GO安排上，顯示8個亞群功能各異。這也是首個人類視網膜外周RPE細胞的轉錄組分析。
作者返回去審查了自己的hRPE細胞差異基因表達結果，發現IGFBP5的特異性較低，而對比差異表達基因的RT-PCR分析結果，外周RPE中CRYAB比IGFBP5更具特異性，可以作為外周RPE的新標記基因（Dear Dr. Voigt, 外周RPE的標記基因更新啦~ 雖然看熱鬧不嫌事兒大，但ID3的地位還是穩固的）。
黃斑RPE與外周RPE的基因表達模式差異
轉錄因子是RPE發育所必需的，作者分析了每個細胞中基因調控網絡的活動。檢測轉錄因子活性（？為什么能這么做，因為有前人報道：在特定細胞類別中50%以上的細胞中活躍的轉錄因子被保留（Hu等人，doi:10.1371/journal.pbio.3000365））的結果顯示，黃斑RPE與外周RPE中轉錄因子具有高度活性（圖4A、B）。NFIB在外周hRPE細胞中高表達；IRX3、FOXP1、KLF2、TWIST1和PBX1在黃斑hRPE細胞中高表達；它們被認為是活性轉錄因子，各自靶基因參與特定生物學過程（圖4C）。大多數轉錄因子活躍在黃斑RPE，提示黃斑RPE在視網膜發育過程中可能在RPE細胞的分化中起重要作用。
但是，黃斑RPE一個“人”就能完成“任務”嗎？當然不！作者分析了外周和黃斑細胞群之間的相互作用（圖4D、E）。檢測亞群之間受體-配體對的結果顯示，前20個受體-配體對中有17個在黃斑RPE中富集，這表明黃斑RPE簇與視覺系統發育密切相關。以上的結果揭示了hRPE中轉錄因子的表達模式，以及RPE亞群之間的相互作用，這兩者都表明黃斑RPE在視覺發育中的重要性（外周RPE不要難過，分量雖小，不可或缺）。
hRPE的發育及其動態轉錄組特征
接下來，作者探究了外周RPE和黃斑RPE簇的轉錄組動力學，繪制出發育軌跡（圖5A-C和E）。在黃斑RPE中，M1簇細胞處于發育早期，M2簇細胞處于發育晚期。在外周RPE中，亞群具有特定的發育順序。進一步的研究還發現，黃斑RPE和外周RPE的特異轉錄因子的表達，包括IRX3、TWIST1、FOXP1、KLF2、PBX1和NFIB，沿偽時間軸發生變化（圖5D-F）。例如，在黃斑RPE中IRX3、TWIST1、FOXP1、KLF2和PBX1的表達逐漸降低。NFIB在外周RPE中的表達也逐漸降低。
人類視網膜疾病相關基因特異性表達模式的分析
作者使用RetNet數據庫（https://sph.uth.edu/retnet/）識別與視網膜疾病相關的基因，并確定了這些基因在作者的數據中的聚類分布。作者發現一些已知的與視網膜疾病相關的基因在不同細胞簇中分別高表達（圖6）。在以前的研究中，與AMD相關的VTN和HTRA1分別在視網膜的光感受器細胞（視桿和視錐）細胞和水平細胞中高度表達。有趣的是，在作者的hRPE數據中，VTN和HTRA1基因在外周RPE的P2和P7細胞簇中高度表達（補充圖S3C）。此外，與AMD相關的其他視網膜疾病致病基因主要表達在P4、P6和P7細胞簇中，但一些易感基因，如C2、FBLN5和TLR4，在黃斑RPE中高度表達。作者分析了亞群中與眼部疾病相關的基因表達，發現許多人類視網膜疾病主要影響黃斑RPE和一些外周RPE，如簇P4和P6。
以上這些結果確定了RPE中多個眼部疾病相關基因的亞群分布，并可能為未來的遺傳相關分析和疾病治療提供信息。
討論
單細胞測序技術有助于詳細分析許多復雜組織的細胞類型和基因表達模式。這篇文章中，作者基于三個樣本的hRPE細胞進行單細胞測序，探究了RPE的異質性，包括細胞分類和功能差異。許多眼部疾病如AMD和色素性視網膜炎與黃斑視網膜密切相關，尤其是視網膜神經節細胞、視錐細胞和視桿細胞；然而，作者的結果表明，許多與這些疾病相關的易感基因在特定的黃斑RPE亞群中選擇性表達。hRPE細胞亞群在這些疾病中的發病機制有待進一步探討。由于hRPE細胞的異質性以及年齡對其異質性的影響，需要進一步的研究來闡明hRPE簇的生理和病理功能。
小編有話說
這篇文章看下來，或許給人的感覺可能是：…那我也可以。畢竟方法都是我們耳熟能詳的聚類、功能富集、PCR等等。但是，小編說過，方法其實沒那么重要，用對的就行，關鍵是研究思路。單細胞的landscape文章可能已經比較普遍，但是仍然有被挖掘和發現的潛力，這一點毋庸置疑。
隨著科學技術和人類醫學研究的不斷進步，單細胞群體的神秘面紗正在慢慢被揭開，這也就意味著單一的單細胞RNA測序文章想發高分雜志已經比較困難。這篇文章基本算是單細胞分析比較“保守”的思路了，自測單細胞landscape的常規分析可能就是這個水平，如果從不一樣的角度進行分析和挖掘，相信會better。
還有重要的一點，不要擔心沒有自測單細胞數據，請堅持相信公共數據有寶藏。不要猶豫，聯系我們。我們不生產數據，我們只是數據的挖掘機。
題外話：這篇文章雖然只有三個樣本（人類的眼睛樣本其實真的很寶貴），但作者兩次闡述了他們發現的現象在三個樣本中是高度一致的，無形中給審稿人和我們灌輸了結果是真的、對的、可信的、是事實（沒有質疑的意思）的理論，僅僅一句“…similar among samples”就體現出了作者的自信。雖然寫文章避免車轱轆話來回說，但業界還是存在不少這樣的現象。“少即是多”，這樣的寫作方法值得借鑒。
