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各位小伙伴大家好呀，今天小編給大家帶來今年1月份發表在Nature communications(IF=17.694)上的一篇關于T細胞耗竭的研究，z作者繪制了詳細的乳腺癌T細胞耗竭相關的免疫微環境圖譜，生物學知識豐富，快來一起學習一下吧！
一.研究背景
免疫檢查點阻斷療法改善了許多癌癥患者的預后，在乳腺癌中的應用仍然局限于三陰性患者，且大多數患者不能獲得長期的臨床獲益。以前認為是由于免疫原性差，但一些研究已經確定了免疫浸潤對乳腺癌進展的強烈影響。在靶細胞清除失敗且T細胞受體(TCR)信號持續存在的慢性炎癥部位，T細胞可能變得“耗竭”，這是一種以抑制性檢查點受體(如PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3)共表達升高為特征的細胞狀態；但最近的研究表明，耗竭性T細胞仍可能在人類腫瘤中增殖，但這些細胞在多大程度上保留其抗腫瘤功能尚不清楚。于是作者使用單細胞轉錄組學(scRNA-seq)結合成像質譜流式(IMC)分析系統地研究了含有或不含有耗竭T細胞的人類乳腺腫瘤的免疫環境，重點關注了管腔(luminal)亞型。描述了衰竭相關的腫瘤免疫微環境(TIME)特征，這有助于發現新的治療靶點，并提出PD-1、CXCL13和MHC-I作為患者分層的新biomarker組合。
二.主要結果
1.乳腺腫瘤免疫環境的單細胞圖譜
為了系統地研究乳腺癌腫瘤免疫微環境(TIME)，作者對14例免疫浸潤性乳腺腫瘤進行了scRNA-seq(圖1a)?；谧髡咧暗难芯?，根據腫瘤和免疫細胞的共同模式對腫瘤患者進行了分組，作者發現一半的樣本含有耗竭T細胞(例如PD-1high/CTLA-4high/CD38highT cells)，于是將其稱為耗竭環境(IE1)；另一半主要含有不表達衰竭標記的T細胞，稱為非耗竭環境(IE2)。經過質量控制，作者保留了119000個高質量的細胞(圖1b、c)，基于已知的marker基因表達情況，手動注釋了主要的細胞類型(圖1d、e)。作者觀察到IE1和IE2腫瘤的主要細胞類型在頻率上沒有顯著差異(圖1f)，盡管不同的T細胞表型導致了IE1和IE2之間的區別，但兩組的整體T細胞頻率是相似的。
為了驗證基于scRNA-seq數據的發現，作者對14個測序樣本保留的12個FFPE樣本進行了IMC分析。對每一個panel分析共獲得了77個感興趣區域(ROIs)(圖1g)，經過數據預處理和細胞分割，每個panel有超過40萬個單細胞，對于細胞數量相似的連續切片，作者手動匹配了ROI，并且根據平均marker表達進行了基于圖聚類，識別了存在的細胞類型(圖1h)；除在scRNA-seq數據集中鑒定的所有細胞類型外，作者在IMC數據中還鑒定到了中性粒細胞，但中性粒細胞通常很少，且在IE1樣本中出現的頻率略高于IE2樣本。
2. PD-1high/CTLA-4high T細胞具有增殖能力，表達腫瘤反應性標志物，并與腫瘤細胞中MHC-I的高表達相一致
為了進一步探究這些腫瘤中T細胞的功能狀態，作者分析了各個T細胞亞型的轉錄組數據，并且加入了NK細胞，因為其與T細胞具有轉錄和功能相似性，據報道也可能發生耗竭。作者首先使用偽bulk(pseudobulk)的方法進行分析，如圖2a所示，IE1中PDCD1、CD276和分別編碼免疫檢查點受體PD-1、B7-H3和TIM-3的HAVCR2表達水平高于IE2，這與之前的細胞計數結果一致；如MKI67、GZMB等與T細胞激活相關的基因IE1的表達水平也高于IE2。此外，編碼三種轉錄因子(IRF4,BATF4和TOX)的mRNA表達水平在IE1的T和NK細胞中也明顯高于IE2(圖2b)，這與TCR信號通路的強弱相關。最后，作者發現IE1的T細胞和NK細胞中細胞因子和細胞因子受體的表達普遍高于IE2，其中CCL3、CXCR6、CSF1和IL13的差異最為顯著，這些細胞因子和細胞因子受體都在炎癥信號傳導中起作用(圖2c)。
為了比較在IE1和IE2免疫環境中T和NK細胞表型的組成，并確定哪些細胞類型具有豐度變化，作者對上兩種細胞類型的scRNA-seq數據進行了重聚類并注釋了細胞亞型(圖2d-f)。高表達衰竭標志物CD8+耗竭T細胞簇、兩個高表達PDCD1的CD4high細胞簇，已知的T濾泡輔助(Tfh)、一個NKT細胞簇在IE1中富集(圖2e、f)，毒性細胞簇在IE2微環境中富集。
接下來，作者更詳細地探討了衰竭相關的表型T細胞狀態。有研究將T細胞耗竭狀態描述為一個連續的過程，在此過程中，自我更新的祖細胞表達轉錄因子TCF7，然后隨著衰竭的增加和增殖潛力的降低而逐漸消失。作者觀察到IE1中TCF7 mRNA的表達減少(圖2b)，特別是在IE1富集的T-CD8耗盡的簇。與IE2相比，IE1環境也富含增殖T細胞(圖2e)。T增殖細胞簇在所有腫瘤反應性和衰竭相關樣本中也富集，與非增殖細胞相比，TCF7的含量較低(圖2h)。這些結果表明表達衰竭特征的毒性T淋巴細胞(CTLs)也表達腫瘤反應特征和增殖標志物。
作者進一步研究了IE1和IE2中CD8+T細胞激活差異的潛在來源。偽bulk分析顯示，與IE2的腫瘤相比，IE1的腫瘤上皮細胞中MHC-I編碼基因的表達顯著高于IE2的腫瘤，這在IMC分析中更為明顯(圖2i)。作者分析表明，MHC I類表達構成了IE1和IE2腫瘤細胞之間的主要差異，MHC-I比PD-L1與CD8+T細胞活化更相關。作者在IMC分析中發現，CXCL13在IE1中的表達在轉錄和蛋白水平上均得到證實(圖2j, k)，并且通過scRNA-seq和IMC檢測到的CXCL13+T細胞在同一腫瘤的兩個獨立片段上的比例高度相關。綜上所述，這些發現表明，在免疫環境衰竭的腫瘤中，T細胞具有增殖能力，顯示出腫瘤反應特征，盡管有最終衰竭的跡象，但可能比免疫環境未衰竭的腫瘤中的T細胞保留更多的抗腫瘤活性。
3. 在衰竭的免疫環境中細胞毒性潛能被改變，但沒有消除
在這一部分，作者研究了兩種免疫環境在T細胞和NK細胞的細胞毒性潛能方面的差異。對IE1和IE2樣本中9個選定基因進行偽bulk比較，結果顯示，在IE2 T細胞和NK細胞中唯一顯著升高的細胞毒性分子是TNF，而GZMB、GNLY和FASL在IE1中表達水平較高(圖3a)。GZMB和FASL在T-CD8耗竭的簇中表達最高(圖3b)，這表明盡管這些T細胞的表型是耗竭，但它們仍具有發揮細胞溶解效應功能的潛力。
為了進一步評估IE1和IE2之間的細胞毒性潛能差異，作者對CD8+T細胞進行了偽時序分析。結果顯示，一端是na?ve T細胞，另一端是耗盡的T細胞，中間是細胞毒性簇(圖3c、d)，且IE1樣本的平均偽時間分數更高(圖3e)，支持免疫耗竭是一個連續統的概念。作者發現在細胞毒性基因中，IFNG和TNF早期升高，其次是GZMB(圖3f)。
為了更好地理解NKT細胞如何作用于IE1環境，作者更詳細地分析了它們的表達譜。CSF1是NKT細胞簇中少數幾個獨特的過表達基因之一(圖3g)，它編碼一種對髓系細胞的活化和分化很重要的細胞因子。因此，T細胞和NK細胞介導的細胞毒性的主要效應物在兩種免疫環境中是不同的。NKT細胞在耗竭T細胞富集的免疫環境中表達CSF1可能代表了T細胞活性和髓細胞介導的免疫反應之間的聯系。
4. 免疫耗竭環境中的髓系細胞表明炎癥增加
于是在這一部分，作者分析了IE1和IE2中的髓系細胞亞群。對髓系細胞(單核細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞，不包括粒細胞)的偽bulk分析(圖4a)顯示，IE1中幾個細胞因子的編碼mRNA過表達，最顯著的是CCL18，它之前被認為與乳腺癌轉移相關。對髓系細胞scRNA-seq數據進行重聚類共注釋出單核細胞(mono)或早期分化的巨噬細胞、腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)、樹突細胞(DCs)和增殖的髓系細胞(圖4b)，大多數單核細胞和TAM簇在IE1腫瘤中更常見(圖4c)，而IE2腫瘤顯示TAM-2簇和經典2型DCs富集。mono-1細胞簇表現出單核細胞特異性的基因標簽，而mono-2細胞簇表現出與多個TAM細胞簇重疊的模式，可能代表單核細胞向成熟巨噬細胞的轉變表型(圖4d)。
作者接下來研究了T細胞和髓系細胞間的相互作用關系。作者從文獻中收集到兩組基因signature定量分析了髓系細胞吸引T細胞和抑制T細胞的特性。兩個signature在單細胞水平、患者水平和表型簇水平均顯示出正相關(圖4e)，提示具有強抑制潛能的髓系細胞也可能主動吸引T細胞。作者還觀察到DC中T細胞抑制的標志物表達，與其他DC相比，migDC簇表現出特別強的T細胞抑制特征(圖4e)，具體體現在腫瘤組織中，migDC的PD-L1編碼蛋白CD274的表達水平最高；軌跡推斷分析(Slingshot)提示cDC2s向migDCs過渡，與之前的研究一致(圖4g)。作者還觀察到在cDC2-migDC的轉變過程中，不同的migDC標記物如CCL17,CCL22,CCL19的表達變化(圖4h)。綜上，有或無耗竭T細胞富集的免疫環境中存在炎癥狀態不同的髓系細胞。
5. 免疫狀態與不同的細胞間通訊模式有關
在這一部分，作者系統地研究了IE1和IE2免疫環境中的細胞相互作用差異。首先作者量化了所有樣本中每個細胞類型對的預測配體受體對(LR)相互作用的總數(圖5a)，揭示了許多預測的成纖維細胞和內皮細胞之間的相互作用，以及髓系細胞的自相互作用。
接下來，作者比較了有和無T細胞耗竭的乳腺腫瘤免疫環境中預測的相互作用，發現了大量富集于IE1或IE2腫瘤的預測LR對(圖5b)。為了研究特定的髓系細胞、T細胞和NK細胞亞型之間如何相互作用，作者關注這些亞型的交互作用分析(圖5c)，為了更好的生物學解釋，作者首先將已識別的cluster聚合成更大的metacluster，每個metacluster代表一個特定的細胞亞型；結果顯示所有T細胞、NK細胞和髓系metacluster都有300到600個預測相互作用，其中TAM自相互作用最為頻繁。
然后，作者使用NicheNet預測哪些髓系衍生配體與T細胞耗竭聯系最密切。最能預測耗竭相關基因表達的髓系來源配體是IL15，其次是IL1B和CXCL16(圖5d)，這與IE1和IE2腫瘤中IL15-IL15受體相互作用的富集的結果一致。總之，作者預測了T細胞與其他細胞的相互作用，并且表明在耗竭型T細胞高的免疫環境中，細胞因子和趨化因子信號傳導增強，特別是髓系細胞與T和NK細胞。
6. 免疫細胞的空間分布隨耗竭而變化
LR分析可以預測細胞間的通信，但它對細胞空間的信息是盲目的。因此，作者使用IMC數據來研究預測的相互作用的細胞是否在空間上也是鄰近的，以及IE1和IE2的空間模式是否不同。作者使用成對鄰域分析來量化每個細胞類型對的相對排斥或相互作用，發現成纖維細胞和內皮細胞在彼此的鄰域內高度富集(圖6a)，與預測的LR相互作用相一致?？傮w而言，與PD-1低表達的T細胞相比，PD-1high T細胞至少有一個migDC作為其直接鄰近細胞(圖6b、c)。作者進一步量化了不同T細胞亞型的近鄰的細胞類型組成，結果表明，與PD-1lowT細胞和Tregs相比，平均而言，PD-1highT細胞被較少的髓系細胞和成纖維細胞包圍，但被更多的其他PD-1highT細胞、pDC和migDCs包圍(圖6d)。
為了確定這些細胞因子周圍的細胞類型，作者定義了細胞因子周圍30μm范圍內的所有細胞，并將這些細胞因子中的細胞類型與整個組織進行了比較(圖6e)，作者發現CD4+T細胞在CXCL9、CCL22和CXCL13環境下富集，而CD8+T細胞在CXCL9和CXCL10環境下富集最高；B細胞在CXCL13環境中顯著富集，migDC在CCL17和CCL22環境中顯著富集，而髓系細胞在CCL18環境中顯著富集(圖6f)。作者進一步對原始樣本進行了免疫熒光玻片掃描，該方法可以直接檢測三級淋巴結構(TLS)，作者發現密集的成熟TLS在IE2分類的腫瘤中更常見，而不成熟TLS在IE1分類的腫瘤中更常見(圖6g)。雖然CXCL13+T細胞在TLS形成中也起作用，但CXCL13+T細胞的空間分布在包含成熟TLS和不成熟TLS的圖像之間發生了變化(圖6h)。
總之，空間分析與主要預測的細胞間相互作用一致，并揭示了細胞因子表達細胞的空間聚集在IE1腫瘤中頻繁出現。且migDC介導的T細胞活性調節是通過直接相互作用發生的，優先發生在或接近成熟和不成熟TLS區域，并且CXCL13+T細胞在不同免疫環境的腫瘤中空間分布上存在差異。
至此這篇文章就介紹完啦，總結一下：作者首先將乳腺癌的腫瘤免疫微環境根據是否富集耗竭性T細胞分為了兩類；第二步詳細的研究了耗竭型和非耗竭型腫瘤中的T細胞功能差異，證明了免疫環境衰竭的腫瘤中，T細胞具有增殖能力，顯示出腫瘤反應特征；第三步由于T細胞活性和髓細胞介導的免疫反應之間的存在聯系，作者對髓系細胞與T細胞間的相互作用進行了詳細的探討；最后，基于預測的配體受體對以及IMC的分析驗證了作者的結論，即在耗竭型T細胞高的免疫環境中，細胞因子和趨化因子信號傳導增強，特別是髓系細胞與T和NK細胞。
這篇文章在小編看來有幾大兩點：第一是T細胞耗竭這個近年來的熱點分析；第二是配對的單細胞測序數據以及FFPE樣本的IMC分析及其具有說服力；第三便是作者的寫作，強烈建議大家去拜讀一下原文，完全可以當做一本關于T細胞耗竭的生物書來看。T細胞耗竭這個熱點，屏幕前的你還不速速學起來，下一篇NC就是你哦！
