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今天給大家介紹一篇發在（《J Immunother Cancer》IF:12+, 中科院一區）雜志上的，關于“單細胞聯合Bulk分析揭示腫瘤相關巨噬細胞在TME中的功能與機制”的文章，題目是“M1 hot tumor-associated macrophages boost tissue-resident memory T cells infiltration and survival in human lung cancer.”
背景介紹
腫瘤相關巨噬細胞的作用在確定適應性免疫系統的抗腫瘤效果與腫瘤的抗免疫策略之間的結果目前依然是有爭議的。巨噬細胞通過整合腫瘤微環境（TME）中的信號來調節其活動和表型。根據巨噬細胞被激活的方式，可以分為M1-like（抗腫瘤特性），或M2-like（促癌特性）。在許多實體腫瘤中，M2-like巨噬細胞的優勢與較差的預后相關，但在某些腫瘤類型中，強的M1-like分布與較好的預后相關。本研究的目的是研究這些腫瘤相關巨噬細胞在人群中的相互關系，以確定他們如何調節適應性免疫系統在早期肺癌中的有效性。
概述
在這篇文章中，作者基于手術切除的肺癌組織，利用單細胞轉錄組測序和bulk測序結合的方式刻畫腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和癌旁組織的非腫瘤相關巨噬細胞（NTAMs）的特征。免疫組化將TAM轉錄組signature的分布與腫瘤中CD8+組織常駐記憶T細胞（TRM）的密度關聯起來，并在393例肺癌患者的獨立隊列的生存數據中進行驗證分析。作者發現TAMs和NTAMs的細胞具有顯著不同的轉錄組譜，并且TAMs展示出了很強的M2-like signature，這在不同樣本之間均是一致的。然而，由免疫染色細胞支持的單細胞RNA測序顯示，在25%的M2-like TAMs樣本中還共同表達了一種很強（或者熱點）的M1-like特征（稱為M1 hot）。作者通過分析發現，M1 hot的TAMs與TRM具有很強的相關性，這些都與患者更好的預后相關。此外，作者表明了一種機制：M1 hot的TAMs通過CXCL9的表達招募TRM細胞，并通過提供TRM所依賴的更多必需脂肪酸來維持它們。
正文結果
結果1：TAM同時富集到M2和M1特征
作者在33個配對的肺癌樣本和癌旁組織的CD45+CD14+HLA-DR+ 細胞的全轉錄組分析（bulk數據），分別鑒定出腫瘤相關巨噬細胞，形成TAMs和NTAMs。通過差異表達分析，識別到1038個差異表達的轉錄本（圖一AB）。通過t-SNE分析，發現這些差異轉錄本能夠很好的將TAMs和NTAMs區分開（圖一C）。基于Ingenuity Pathway Analysis (IPA)工具分別揭示了與M2樣和M1樣巨噬細胞基因圖譜相關的促腫瘤和抗腫瘤功能的強烈激活（圖一D）。此外，作者發現與M2原瘤功能相關的轉錄本，如血管生成（血管內皮生長因子信號傳導）、金屬蛋白酶活性、纖維化和癌癥轉移，在TAMs中表達水平高于NTAMs（圖一E），這個結果在GSEA結果中得以證實（圖二）。
（圖一）
（圖二）
此外，作者發現，與 NTAMs相比，IL-4、IL-10、IL-13和轉化生長因子-β(TGF-β)等M2誘導細胞因子是TAMs的top上游調控因子，但令人驚訝的是，典型的M1誘導細胞因子如IFN-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α也表現出類似的現象（圖三）。這些數據表明肺癌中的TAMs同時表達了與M2基因圖譜（腫瘤原體功能相關）和M1基因圖譜（促進抗腫瘤T細胞反應有關）相關的更高水平的轉錄本。
（圖三）
結果2： M2類型TAM中均一而M1類型TAM異質性的特征分析
接下來，作者想知道根據bulk轉錄組測序數據，是否可以使用M1-like和M2-like signature基因（稱為hot或cold）的相對富集對腫瘤樣本中的TAMs進行分層，以確定不同的原瘤或抗腫瘤作用。作者從前人的研究中獲取到122個已知的M2基因（包括CD209, IL10, WNT5A and MMP12等）和116個M1基因（包括CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, STAT1 and AIM2等）。分析發現，M2基因集在TAMs樣本中表現出比較均一性（即比較統一），而M1基因集在TAMs樣本中表現出異質性（圖四ABC）。
（圖四）
在這個結果基礎上，作者想知道，在含有這些M1 hot 的TAMs腫瘤中，是否與M2 TAMs存在互惠（reciprocal）關系，從而顯示出較弱的M2信號。因此，作者挑選M1中異質性最強的代表基因之一CXCL9（圖4B），并計算了CXCL9表達水平與M2基因(CD209, ADORA3, STAT6, SOCS3, IL10 and IRF4)的相關性，發現其實是不相關的（圖4D）。并且在TAMs和NTAMs腫瘤的對比中，CXCL9與M2 marker基因MMP12的表達模式也是不一致的（圖4E）。這些結果表明，所有肺癌腫瘤中的TAMs都顯示了強大且均一的M2基因圖譜。
結果3： 單細胞RNA-seq揭示了具有雙M1和M2特征的TAM亞群
接下來，作者希望確定TAM群體到底是M1或M2表型不同比例細胞的混合物(這是大多數之前的文獻所表明的)，還是單個TAM細胞可能同時表達M1和M2特征。作者對額外兩名早期肺癌患者的腫瘤和鄰近正常肺組織分離的純化巨噬細胞群進行單細胞RNA-seq分析（約9000個細胞，分成8個clusters；圖五A）。發現在NTAMs上調的因子主要富集到正常組織的Cluster1和Cluster4細胞中，而在TAMs上調的因子主要富集到肺癌組織的Cluster2和Cluster3細胞中（圖五BC）。此外，作者發現M2-like基因signature在兩個TAM富集的Cluster（Cluster2和Cluster3）中均上調，而M1-like的signature只在cluster 3細胞中上調（圖五D-F）。并且在bulk水平發現，富集在cluster 3細胞中的基因與STAT1（已知的主要調節因子介導對IFN-γ的反應，并參與激活M1相關基因的表達）呈現共表達（圖五G）。這些數據證明了M1相關基因和M2相關基因可以在同一個細胞中表現出很強的共表達現象。作者又通過共聚焦顯微鏡（Confocal microscopy）實驗發現M1-like和M2-like各自的經典marker（CXCL9 and MMP12）在TAMs腫瘤中發生了共表達，而在NTAMs腫瘤中卻表現出較低的表達水平（圖五H）。這些發現表明存在具有雙M1和M2特征的TAM亞群（即Cluster2和Cluster3），其中一個亞群（cluster 3）表現出M1和M2雙特征上調（稱M1 hot），而另外一個亞群（cluster 2）僅表現出M2特征上調（稱M1 cold）。
（圖五）
結果4： M1 hot亞群的TAMs與T細胞反應相關
為了探索M1 hot亞群的TAMs的抗腫瘤免疫功能，作者選擇M1 marker基因CXCL9將bulk樣本分為3類：M1 hot (top 25%)，M1 int (25%-75%)，M1 cold (bottom 25%)（圖六A）。連同NTAMs腫瘤，作者發現CXCL9, CXCL10 等 M1 marker基因在M1 hot的TAMs（而非M1 cold的TAMs）中要顯著高于NTAMs腫瘤，而CD209, MMP12等M2 marker基因在M1 hot和M1 cold的TAMs中都要顯著高于NTAMs腫瘤（圖六ABC）。接下來，作者對M1 hot和M1 cold的TAMs腫瘤進行差異表達分析，共識別到222個差異表達的轉錄本（圖六D）。IPA pathway分析發現，M1 hot上調的轉錄本主要參與抗腫瘤T細胞免疫反應相關pathway，例如：TH1 T細胞招募（ 表達更高的CCL5, CXCL9, CXCL10以及CXCL11）, 抗原呈遞, T細胞擴張, 效應T細胞的毒性與分化（圖六E）。此外，發現M1 hot腫瘤比M1 cold腫瘤更高的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞密度（圖六F）。GSEA分析發現，M1 signature基因富集到高CD8+ T細胞的腫瘤中，而M2 signature基因卻沒有呈現出與CD8+ T細胞的相關性（圖六G）。這些數據表明，在行使M2功能時，M1 hot TAMs可能參與了T細胞的招募和增殖，因此可以塑造抗腫瘤反應的質量或規模。
（圖六）
結果5： M1 hot亞群的TAMs與改善患者生存相關
在這節當中，作者首先通過免疫染色的方式確定基于CXCL9表達水平分組 M1 hot TAMs的方式是靠譜的（圖七A），比如說免疫組化M1 hot的患者具有與更高水平的CXCL9表達和CD8+ T細胞密度（圖七BC）。已知CXCL9是表達CXCR3的T細胞的一種已知的趨化劑，作者通過比較分析也發現其正向相關性，共聚焦顯微鏡實驗發現二者在T細胞膜上共定位（圖七DE）。接下來，作者在一套獨立驗證集（n=393, 南安普頓大學醫院搜集，基于CXCL9免疫組化分組）和TCGA 肺腺癌（n=495,基于CXCL9 RNA-seq分組）進行生存分析，均發現M1 hot與更好的生存相關（即高表達或高豐都的CXCL9與更患者更好的預后相關）（圖七FG）。進一步，作者在TCGA肺腺癌中發現，CXCL9表達與CXCR3表達呈現很強的正向相關性，并且CXCR3也與更患者更好的預后相關（圖七HI），這證實了上述的發現。這些結果表明 M1 hot 狀態通過招募更好的抗腫瘤TIL反應進而表現出與患者更長生存的相關性。
（圖七）
結果6： M1 hot亞群的TAMs通過攝取脂肪酸來維持TRM細胞
在這套搜集來的隊列中（n=393），作者分別通過CXCL9（M1 marker）和CD103（TRM marker）免疫組化狀態將患者分組，分別是M1 (M1 hot、M1 int、M1 cold)和TRM (TRM high、TRM int、TRM cold)。通過比較分析發現TRM high的患者更傾向于屬于M1 hot類，并且TRM low的患者更傾向于是M1 cold類（圖八A）。此外，作者通過比較M1 hot和M1 cold分組中腫瘤浸潤CD8+ T細胞的轉錄本（與TRM相關的基因）表達水平，發現上調的轉錄本也在M1 hot患者中高表達（圖八B）。并且連同TRM signature基因、細胞周期以及細胞毒性/細因子signature基因均更傾向于富集到M1 hot上調基因集中（圖八C）。這些結果表明M1 hot是與TRM相關的。
（圖八）
接下來，作者評估了M1 hot TAMs如何影響或調節TRM在腫瘤微環境中的反應。通過分析發現，M1 hot TAMs呈現出更低的脂肪酸結合蛋白（FABP3, FABP4 and FABP5）的表達水平（圖八D）。眾所周知，為了在組織中生存，TRM細胞依賴于通過FABP4/5攝取必需營養脂肪酸。并且研究表明，IL-4 （M1 cold因子）處理的巨噬細胞會增加其脂肪酸攝取。因此，作者假設M1 cold的TAMs會比M1 hot的TAMs在腫瘤微環境中更有效地競爭脂肪酸（由于高表達FABP3, FABP4 and FABP5），并因此在這一必需營養素的競爭中勝過TRM細胞，從而損害了腫瘤中TRM細胞的長期維持。
為了驗證這一假設，作者用IFN-γ/LPS和IL-4處理血源性巨噬細胞(BDMs)，以分別模擬M1 hot和M1 cold TAMs。通過比較分析發現，與M1 cold-like的BDMs (IL-4)相比，M1 hot-like的BDMs (IFN-γ和LPS)顯示出脂肪酸攝取減少（圖八E）。這個現象在通過siRNA敲除脂肪酸結合蛋白（FABP3, FABP4 and FABP5）的實驗中也得以呈現。此外，通過血液中提取的M1 hot-like的BDMs、M1 cold-like的BDMs分別與CD8+CD103+ T細胞進行共培養，發現當CD8+CD103+ T細胞與M1 hot-like的BDMs與共培養時，表現出更強的脂肪酸攝取（圖八F），而其他的T細胞卻并未呈現類似的現象。這個實驗表明，M1 cold TAM可能通過細胞間對脂質營養物質的競爭的機制減少腫瘤中TRM細胞的生存和維持。
結語
這篇文章是比較典型的單細胞數據結合bulk數據，生物信息分析結合實驗的分析。本文最大的亮點是識別了一個具有M1和M2雙特征的腫瘤相關巨噬細胞的亞群，并將其與患者生存、T細胞擴張、特別是組織駐留記憶T細胞的生長維持直接掛鉤。很好的揭示了它們之間的內在聯系和分子機理，邏輯也比較清晰，為肺癌腫瘤相關巨噬細胞對腫瘤微環境的影響提供新的視角。
參考文獻：
M1 hot tumor-associated macrophages boost tissue-resident memory T cells infiltration and survival in human lung cancer. J Immunother Cancer. 2020
