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單細胞技術為研究人員提供了重要的幫助，無論實在實驗室還是在臨床上。大多數的研究人員都能在研究中熟練使用單細胞方法技術的流程和分析，如無監督聚類、系統發生、軌跡推斷、RNA速率分析、譜系追蹤和配體受體相互作用映射等。但是，對于高維單細胞方法如何被研究腫瘤細胞和它們的微環境之間的相互作用，特別是它如何與抗癌免疫治療反應相關，可能還缺乏一定的了解。今年四月份發表在Nature reviews. Clinical oncology（IF:66.674）的一篇綜述可能為我們提供幫助。
Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy
背景介紹
腫瘤是惡性細胞、免疫細胞和間質細胞的復雜混合物，通常具有相當程度的瘤內和瘤間異質性。腫瘤微環境(TME)包括促腫瘤和抗腫瘤信號的混合物，能夠調節腫瘤生長和影響腫瘤進化。Bulk基因組和轉錄組分析為這些過程提供了有價值的見解，但是，在bulk水平上，獲取的是大量細胞平均后的信號，往往掩蓋了特定的亞群或細胞狀態。
事實上，罕見和獨特的細胞亞型或狀態可能在疾病生物學中發揮重要作用，如潛在的癌癥干細胞、對治療反應至關重要的免疫細胞等，這些可能無法在bulk水平的分析中檢測到，但是對于癌癥免疫治療、新免疫療法或獲得性耐藥性反應至關重要。
幾十年來，人們已經認識到單細胞分析的巨大力量。并且單細胞方法有助于回答許多腫瘤免疫學中持續存在的問題，如：腫瘤和免疫細胞異質性的作用(包括抗原提呈機制表達的異質性)；T細胞克隆型與表型的關系；TME中存在的免疫-檢查點相互作用網絡；腫瘤細胞與免疫細胞之間以及不同免疫細胞類型之間的空間功能關系。
這篇綜述的重點主要有一下幾個方面：
第一章：單個細胞組學分析
一、轉錄組學：
單細胞RNA測序(scRNA-seq)是指一組技術，能夠對存在于單個細胞中的轉錄本進行非靶向量化。作為一種非靶向的研究轉錄組的方法，scRNA-seq可以識別新的細胞類型，確定罕見細胞亞群，并定義細胞狀態和系統發育的譜系（圖1）。在下面的小節中，將詳細討論幾個足以說明scRNA-seq價值的例子。
1、 腫瘤細胞和免疫應答
通過scRNA-seq分析，無論是在個體腫瘤間還是個體腫瘤內部，腫瘤異質性是腫瘤細胞主要特征。這種患者-患者的異質性使利用腫瘤細胞的scRNA-seq來研究治療應答變得復雜。因此，在識別與患者共享的免疫治療反應相關的細胞類型和狀態方面，免疫細胞和基質細胞的單細胞分析取得了更豐碩的成果。（PS：所以，腫瘤微環境是近兩年研究的熱點，也將是接下來研究的重點。如果無法從復雜的腫瘤細胞中獲得成果，不妨試試腫瘤微環境。）
盡管存在這種異質性，但用患者共有的特定轉錄狀態識別惡性細胞是可能的。對單個腫瘤細胞轉錄組的研究已經細化了腫瘤類型及其細胞層次的分類，也使能夠識別與治療反應或耐藥性相關的轉錄組全范圍的特征。
2、免疫細胞/基質細胞和免疫應答
總的來說，全面了解免疫細胞的組成和狀態對于理解當前免疫應答和耐藥性，以及合理設計新的免疫調節療法和組合至關重要。這一領域的初步努力是構建非惡性腫瘤組織中細胞的詳細免疫圖譜，然后將這些圖譜和方法應用于腫瘤環境。
將單細胞轉錄映射擴展到一系列腫瘤類型的TME，揭示了一些關于癌癥免疫反應的異質性和多樣性的有趣見解。一個重要的發現是，基于細胞狀態的非靶向轉錄評估的聚類往往不能根據細胞表面蛋白表達清晰地劃分為傳統的免疫細胞亞群，從而導致對免疫細胞在TME中的作用有更微妙的理解。
在免疫治療的背景下，將這些方法應用于TME中存在的免疫細胞和基質細胞，可以闡明對免疫治療(如ICIs)產生應答和耐藥性的轉錄狀態。更重要的是，繪制多種腫瘤類型免疫landscape的分析已經發現了一個新生的、但正在增長的、與淋巴細胞、DC、單核細胞、巨噬細胞和成纖維細胞室對免疫治療反應相關的轉錄狀態組合，其中很多都被當作公認的生物標志物來研究。
3、互作分析
許多研究已經探索了腫瘤細胞或免疫細胞和/或基質細胞的作用，盡管這些細胞類型之間和內部的復雜相互作用在癌癥生物學中具有關鍵作用。這些重要的細胞-細胞相互作用的信息可以從scRNA-seq數據中推斷出來，通過關聯不同細胞類型之間的配體-受體對的表達。例如，張澤民老師團隊對細胞相互作用的評估為腫瘤相關的樹突狀細胞和外周T細胞之間的互作提供了見解。
[Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma. Cell. 2019 41.582]
而新的技術正在開發的方法，能夠探索物理細胞-細胞相互作用，如在空間上解析scRNA-seq的方法——試圖更好地理解腫瘤細胞和TME之間復雜的相互作用。這些都是今后研究者可以努力的方向。
4、scRNA-seq的局限
盡管scRNA-seq也有一定的缺陷，但它已經徹底改變了細胞類型和細胞狀態的描述。scRNA-seq數據本質上是嘈雜的，因為真核生物的轉錄并不以一致的基礎速率進行。
所以對于我們拿到的單細胞數據中的0值，這些0值出現有兩種完全相反的可能——1.這些基因在細胞中本身就是不活躍的；2.該基因是活躍的，但是由于細胞轉錄動態學和采樣時間的煙癮，轉錄本并沒有被檢測到，或者由于技術原因，導致該基因的表達沒有被檢測到。
不過通過考慮整個轉錄組的情況，可以幫助解決這個局限——如通過差異表達基因的進行聚類。因此，對單細胞結果的解釋應該集中在pathway分析和基因集富集上，而不是任何單一基因的表達或影響。
其次，僅使用轉錄組數據來建立基因型和表現型之間的相關性仍然具有挑戰性。例如，scRNA-seq數據被用來推斷體細胞拷貝數變異(通常稱為sCNVs)，但這只適用于相對較大的缺失或擴增。而對于sSNVs評估比sCNVs需要更高的分辨率，且現今來講，置信度仍舊是一個挑戰。因此，在評估個體腫瘤細胞的體細胞突變對治療反應或耐藥性的影響時，scRNA-seq方法是一種不理想的方法。
除了scRNA-seq的這些固有局限性之外，與樣品和處理相關的具體細節也會影響結果，以及在不同的時間處理樣品，即使有輕微的技術差異，也會出現批效應，需要有效的方法來避免這些誤差。
二、蛋白組學
1、質譜流式細胞術
單細胞蛋白質組學研究主要依賴于使用抗體或類似親和試劑進行選擇性靶標檢測。長期以來，在單細胞分辨率水平上，流式細胞術一直是研究人員評估蛋白表達的主要手段，盡管可以同時檢測到的表位的數量受到熒光團之間光譜重疊的限制。
2、單細胞蛋白質組分析的新興技術
下一代光譜分析儀有望將基于熒光的流式細胞術的能力擴展到可與大規模細胞術相媲美的水平。這些系統相對于大規模細胞檢測的優勢是,能夠利用大量熒光標記抗體，因為它們不像大規模細胞檢測那樣破壞細胞，因此能夠在后續實驗中對細胞進行分離和分類。這些光譜分析儀和微流體系統的新平臺仍處于開發的早期階段，需要在其他臨床環境中進行驗證。盡管如此，它們將在免疫腫瘤學中發揮越來越重要的作用。
三、基因組學
對單細胞進行全基因組和全外顯子組測序的方法已經開發出來，盡管這些方法尚未過渡到高維分析，最主要的原因是這種測序的成本過高，限制了大規模的對每個患者進行大量細胞的測序。一種更有效的方法是：首先使用bulk腫瘤DNA樣本的深度測序來識別sSNVs，然后使用單細胞DNA的靶向測序來檢測假定的driver突變或克隆結構中涉及的突變。盡管該系統尚未應用于免疫治療，但已用于分析數十萬單個細胞，通過急性髓系白血病患者的診斷、緩解和復發追蹤特異性突變，從而證明了該技術的前景。
四、表觀基因組學
表觀基因組分析方法，如轉座酶染色質測序(ATAC-seq，它可以檢測染色質的開放片段)，基于亞硫酸氫鹽的DNA甲基化測序，染色質免疫共沉淀測序(ChIP-seq，檢測DNA蛋白質相互作用)和染色體構象捕獲(如3C和Hi-C)，都已適用于單細胞分析。在這些方法中，scATAC-seq是目前唯一的高通量測序方法，因此被廣泛使用。隨著測序技術的不斷進步，單細胞表觀基因組學是一個快速發展的領域，特別是當與單細胞轉錄組學結合時，很可能成為腫瘤單細胞分析的下一個主要進展之一。
五、多模式分析
研究人員對于將不同的單細胞分析模式整合到綜合技術中的興趣正在增加。下面簡要回顧了幾種具有廣泛適用性的、具有前景的方法，但迄今為止，這種多模式方法在研究對免疫應答方面的應用仍受到限制，需要研究人員的不斷努力。
1、RNA/DNA+蛋白
使用與條形碼寡核苷酸結合的抗體，將單細胞蛋白質檢測技術和scRNA-seq協議（如 CITE-seq 和 REAP-seq）結合，通過 scRNA-seq 的 cDNA 測序步驟檢測基于蛋白質的標記，從而使蛋白質檢測不受光譜重疊或可解析金屬離子數量的限制。將基于抗體的數十到數百種蛋白質的檢測添加到非靶向轉錄組分析中的能力，通過在傳統免疫學的框架內定義轉錄簇和減少由轉錄退出引起的歧義，大大提高評估TME的能力。
2、譜系追蹤
scATAC-seq數據包含來自線粒體基因組的測序read。盡管這些信號最初被視為實驗性干擾，但此功能可以檢測可用于進行克隆追蹤的線粒體突變。因此，scATAC-seq 能夠同時測量細胞譜系（通過線粒體基因組）和細胞命運（通過核表觀基因組）。線粒體突變也可以在scRNA-seq 數據中檢測到，但由于線粒體基因組的覆蓋范圍較低且不一致，因此不如 scATAC-seq 數據中的檢測那么有效。這種譜系追蹤分析可以在未來應用，以更好地了解哪些腫瘤細胞克隆響應特定治療而擴大或收縮，從而哪些克隆可能與治療耐藥性有關。
第二章：單細胞TCR分析
T細胞是適應性免疫系統的主要分支，負責抗腫瘤免疫，因此是大多數FDA批準的癌癥免疫療法的主要焦點。所以，單個T細胞克隆型的分析是目前越來越多研究人員的興趣所在，是目前該領域的熱點所在。
TCR是由兩條鏈組成的異源二聚體，其基因重組產生了多樣化的TCR庫。大多數T細胞(95%)攜帶單獨的TCR α和β亞基，它們共同識別同源肽MHC抗原。基于這種TCR多肽MHC相互作用，在免疫原性腫瘤中自然發生的TILs（腫瘤浸潤淋巴細胞）具有消除腫瘤的潛力。確定T細胞能否靶向腫瘤細胞，需要單細胞配對的TCR α和β亞基序列用于TCR重構和特異性檢測。
此外，為了使免疫療法產生有效的抗原特異性抗腫瘤免疫反應，腫瘤抗原最終必須作為抗原MHC復合物呈遞，并被腫瘤浸潤T細胞上的同源TCR識別。越來越多的證據表明，許多腫瘤浸潤T細胞只是“旁觀者”，無法識別和攻擊腫瘤細胞。腫瘤可能表現為免疫效應細胞的高度浸潤，但由于缺乏具有抗腫瘤活性的腫瘤特異性T細胞，因此，腫瘤在性質上是冷的。通過量化細胞組成和表征轉錄狀態，單細胞方法還可以識別成對的α和β亞基，這是確定浸潤T細胞特異性的關鍵步驟。這些信息不僅有助于解釋當前免疫療法的耐藥性（例如缺乏腫瘤特異性），還有助于發現可用于新型工程化TCR細胞療法的高親和力抗腫瘤TCR。
第三章：高維空間分析
腫瘤免疫微環境的空間高變異性越來越被認為是導致大多數癌癥類型的異質性和治療反應變化多端的原因。空間方法可以追溯到Coons等人的免疫組化和免疫熒光對蛋白進行選擇性免疫染色和Gall和Pardue等人的核酸序列的原位雜交，它們已經成為癌癥診斷、分類、治療選擇和預測不可或缺的方法。在過去的幾年里，隨著生物信息學的進步，這些更傳統的方法得到了極大的擴展，使同時可視化蛋白質、DNA、RNA分子成為可能。還在開發幾種將空間分辨率與下一代測序結合起來的方法，如：
盡管技術上仍處于初步階段，空間分辨率的多路分析方法卻正在重塑細胞間互作和腫瘤細胞、TME細胞之間的研究方式，而腫瘤的TME控制著腫瘤免疫和患者的免疫應答。
第四章：未來方向
scRNA-seq及其多種多樣的模式是革命性的研究工具，正在推進對人類癌癥免疫學的理解，以及驅動患者對免疫治療的反應性和耐藥性的機制。盡管免疫療法已經改變了許多晚期惡性腫瘤的治療，但大多數患者要么對這些藥物無效，要么最終獲得耐藥性。
大量的臨床試驗正在探索免疫治療的聯合方法，這些研究已經完成或者這在進行。盡管如此，克服原發性和獲得性耐藥性的合理免疫治療組合，需要對每種癌癥類型的腫瘤免疫微環境進行全面表征，以及在治療過程中對有效抗腫瘤免疫的決定因素的詳細理解。單細胞技術能夠全面分析TME，因此特別適合研究腫瘤和免疫細胞的異質性，以及腫瘤生物學中的這種差異如何有助于治療耐藥。
然而在臨床上看來，許多技術太過于昂貴，因此必須考慮需要收集樣本的類型、形式、最佳收集時間等。雖然具有挑戰性，但從相對較少的患者的深入調查中，大樣本的分析更有效、也能提供更直接的見解(圖4)。
結束語
分子生物學、微流體技術和生物信息學的進展，研究人員逐漸能夠在單細胞水平上研究數以千計的惡性腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞的基因組、轉錄組、表觀基因組和蛋白質組學。高維、多方面的特征能夠解剖腫瘤異質性、腫瘤細胞及其微環境之間復雜的相互作用，以及腫瘤進化軌跡的細節。這篇綜述通過單細胞轉錄組學、基因組學、蛋白組學、TCR以及高維空間組學等方面，詳盡的講述了單細胞技術在免疫治療中的可行性，以及今后研究者的研究方向，為我們了解單細胞應用癌癥免疫治療提供了很大的幫助。
