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m6A甲基化作為研究的熱點(diǎn)，目前有很多的研究方向，其研究領(lǐng)域涉及生長(zhǎng)發(fā)育的方方面面。如果想選RNA甲基化作為方向設(shè)計(jì)課題，可以從哪些方面著手？今天的文章圍繞m6A甲基化的整體研究思路展開，探討m6A相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白分析、m6A+免疫浸潤(rùn)、m6A預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型這三個(gè)經(jīng)典思路，全程干貨！
m6A相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白分析
m6A甲基化研究無(wú)非是圍繞著甲基化轉(zhuǎn)移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化閱讀蛋白(Readers)這三大組分展開相應(yīng)的研究,最為典型的研究就是從m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白入手，深入闡明m6A修飾生物學(xué)功能和作用機(jī)制，一般套路為由甲基化轉(zhuǎn)移酶/去甲基化酶/閱讀蛋白差異，到研究靶基因修飾變化，再到靶基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化，得出m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)基因異常影響細(xì)胞表型和功能特征。
下面我們通過(guò)一篇在Journal of Hematology & Oncology （IF=17.388）的文章對(duì)其研究思路進(jìn)行解析吧。
研究思路：
1、從m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白(甲基化酶、去甲基化酶和閱讀蛋白)入手，發(fā)現(xiàn)某個(gè)蛋白差異，做敲低/過(guò)表達(dá)該蛋白，腫瘤惡性生物學(xué)表型改變。
1.1 找到其中膠質(zhì)瘤中存在顯著差異表達(dá)m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白，在mRNA和蛋白水平均證實(shí)RNA m6A閱讀蛋白YTHDF2表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級(jí)別升高、預(yù)后不良顯著正相關(guān)。
1.2 通過(guò)鑒定了與 YTHDF2 表達(dá)正相關(guān)的基因，探索 YTHDF2 表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤功能的潛在影響。進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)重疊基因富含惡性腫瘤相關(guān)的生物過(guò)程，包括細(xì)胞周期、RNA 代謝和細(xì)胞周期相變。
1.3 敲低或過(guò)表達(dá)YTHDF2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞增殖和遷移能力減弱或增強(qiáng)。證實(shí)YTHDF2表達(dá)水平升高可促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)表型。
2、探索m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白在膠質(zhì)瘤中致癌作用的潛在途徑，向下游找靶標(biāo)，尋找調(diào)控下游的通路或蛋白，根據(jù)m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白在m6A修飾的作用，進(jìn)一步探索其致癌機(jī)制。
2.1 尋找與 YTHDF2 表達(dá)正相關(guān)的基因的富集途徑和免疫染色發(fā)現(xiàn)NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)是最顯著的富集途徑，并在敲低YTHDF2的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)NF-κB（p65）的核分布降低。
2.2 由于YTHDF2 最明顯的作用是閱讀 m6A 修飾加速 mRNA 衰減，假設(shè) YTHDF2 可能通過(guò)降解負(fù)調(diào)節(jié) NF-κB 的基因的 RNA 來(lái)激活 NF-κB。通過(guò)GO term 和文獻(xiàn)收集76 個(gè)負(fù)調(diào)節(jié) NF-κB 信號(hào)通路的基因。通過(guò)富集分析和相關(guān)性檢驗(yàn)確定YTHDF2 對(duì) NF-κB 負(fù)調(diào)節(jié)的靶標(biāo)--- UBXN1。
2.3 通過(guò)敲低或過(guò)表達(dá)YTHDF2的表達(dá)，可以看到UBXN1 的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)以及磷酸化-NF-κB（pp65）降低。表明 YTHDF2 上調(diào)可以通過(guò)抑制 UBXN1 表達(dá)來(lái)誘導(dǎo) NF-κB 活化。
3、探究靶標(biāo)上存在m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白閱讀的m6A修飾位點(diǎn)，并證明該修飾位點(diǎn)介導(dǎo)的m6A修飾引起靶標(biāo) RNA分子的功能變化。
3.1 通過(guò)MeRIP 測(cè)序及檢查表觀轉(zhuǎn)錄目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)UBXN1 mRNA 3'端周圍的 m6A 修飾位點(diǎn)有可能被 YTHDF2 閱讀.
3.2 又由于METTL3的表達(dá)決定了膠質(zhì)瘤中 RNA 的 m6A 修飾水平，對(duì)有或沒(méi)有 METTL3 敲低的 U87 細(xì)胞進(jìn)行了 MeRIP 測(cè)序和RIP-PCR 實(shí)驗(yàn)，UBXN1 mRNA 上存在 METTL3 介導(dǎo)的 m6A 修飾位點(diǎn)，它們有可能被膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的 YTHDF2 閱讀。
3.3 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由METTL3介導(dǎo)的UBXN1 mRNA 3’端m6A修飾水平可調(diào)控YTHDF2對(duì)UBXN1 mRNA的閱讀，并導(dǎo)致UBXN1 mRNA的衰減。
4、進(jìn)一步證實(shí)m6A修飾相關(guān)調(diào)控蛋白對(duì)膠質(zhì)瘤惡性表型的影響的分子機(jī)制。
4.1 通過(guò)過(guò)表達(dá) YTHDF2 的細(xì)胞中過(guò)表達(dá) UBXN1，進(jìn)行CCK-8 測(cè)定、transwell 分析和蛋白質(zhì)印跡均表明UBXN1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了 YTHDF2 對(duì)腫瘤惡性表型和 NF-κB 激活的影響。
4.2 通過(guò)表達(dá)空載體、YTHDF2 過(guò)表達(dá)載體或 METTL3 過(guò)表達(dá)載體的熒光素酶標(biāo)記的 U87 細(xì)胞注射到裸鼠的大腦中，證明了YTHDF2通過(guò)閱讀METTL3介導(dǎo)的m6A修飾來(lái)促進(jìn)UXBN1 mRNA降解，從而激活NF-κB信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的新機(jī)制。
m6A + 免疫浸潤(rùn)
接下來(lái)的研究中不再局限于單一的m6A調(diào)控蛋白的調(diào)控機(jī)制，而是聚焦于多個(gè)調(diào)控蛋白之間于免疫浸潤(rùn)的關(guān)系。一般思路為m6A調(diào)節(jié)因子聚類---免疫浸潤(rùn)亞型分析---m6A和免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析---構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。
通過(guò)一篇發(fā)自Artificial Cells Nanomedicine and Biotechnology（IF=5.678）上的研究來(lái)解析其研究思路吧。作者系統(tǒng)地研究了前列腺癌中重要的m6A調(diào)節(jié)因子與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性。
研究思路
1、分析前列腺癌和正常樣本間m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)差異。
1.1 首先確定了24個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子，包括9個(gè)writers、2個(gè)earsers和13個(gè)readers，通過(guò)TCGA 和 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其表達(dá)水平。
1.2 熱圖和箱線圖了解腫瘤和正常樣本之間的差異。
1.3 整合體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)確定了前列腺癌中m6A調(diào)節(jié)因子的突變率。
2、研究各個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與前列腺癌標(biāo)志相關(guān)通路活性之間的相關(guān)性
2.1 使用 m6A 調(diào)節(jié)器網(wǎng)絡(luò)描繪了 m6A 調(diào)節(jié)器相互作用、前列腺癌患者調(diào)節(jié)器連接的綜合景觀，并繪制其相關(guān)圖。
2.2 采用富集分析探索m6A調(diào)節(jié)劑的生物學(xué)功能。
2.3 研究writers、earsers和readers的調(diào)節(jié)器之間的串?dāng)_在不同m6A 修飾模式的形成下的作用。
3、研究m6A 調(diào)節(jié)因子對(duì)前列腺癌免疫微環(huán)境的影響
3.1 tossGSEA 分析評(píng)估每個(gè)基因組的免疫浸潤(rùn)水平并將患者分為兩個(gè)免疫組。
3.2 研究高、低免疫浸潤(rùn)組的 TME 評(píng)分（免疫評(píng)分、估計(jì)評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分、腫瘤純度）差異在 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.3 評(píng)估了免疫浸潤(rùn)簇與臨床預(yù)后特征之間的關(guān)聯(lián)。
3.4 研究免疫浸潤(rùn)簇之間 m6A 調(diào)節(jié)因子表達(dá)的是否存在顯著差異。
4、前列腺癌中m6A 調(diào)節(jié)因子的一致性聚類
4. 1 對(duì)前列腺癌隊(duì)列中24 個(gè) m6A 調(diào)節(jié)因子的無(wú)監(jiān)督聚類，將m6A 調(diào)節(jié)因子分為4簇，其中采用主成分分析 (PCA) 以便更好的劃分簇 4 和其他簇。
4.2 采用Kaplan-Meier 證明四個(gè)集群之間的預(yù)后存在顯著差異。
4.3 熱圖表明不同簇中的 29 個(gè)免疫相關(guān)基因特征，并計(jì)算四個(gè)簇之間m6A基因表達(dá)的差異。結(jié)果表明m6A無(wú)監(jiān)督聚類與 TME 相關(guān)。
5、m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的預(yù)后特征構(gòu)建，與免疫相關(guān)基因的預(yù)后評(píng)分風(fēng)險(xiǎn)分析
5.1 為了研究這 24 個(gè) m6A 基因在前列腺癌中的預(yù)后價(jià)值，構(gòu)建單變量 cox 生存回歸分析，緊接著采用lasso回歸模型構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型。
5.2 根據(jù)risk-score 劃分高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，通過(guò)熱圖表明高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組存在顯著差異。
5.3 評(píng)估模型。Kaplan-Meier和ROC曲線驗(yàn)證診斷和預(yù)后價(jià)值。
5.4 通過(guò)熱圖研究風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型中的 29 個(gè)免疫相關(guān)基因特征，結(jié)果顯示24個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型與TME顯著相關(guān)。
5.5 多種類型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析。研究了 22 個(gè)免疫細(xì)胞亞群中前列腺癌和正常組織中免疫浸潤(rùn)的差異。通過(guò)小提琴圖對(duì)三個(gè)免疫浸潤(rùn)簇（高、中、低）中22種免疫細(xì)胞表型的差異進(jìn)行可視化，結(jié)果表明16 個(gè)免疫細(xì)胞在三個(gè)簇之間呈現(xiàn)差異表達(dá)譜。緊接著前列腺癌患者的 m6A 調(diào)節(jié)因子的無(wú)監(jiān)督聚類和lasso回歸風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型中的免疫浸潤(rùn)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)六個(gè)免疫細(xì)胞在四個(gè)m6A簇之間呈現(xiàn)差異表達(dá)譜。
風(fēng)險(xiǎn)模型
構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型可以說(shuō)時(shí)研究癌癥的一個(gè)非常經(jīng)典的套路了，下面這篇發(fā)自Molecular Therapy-Nucleic Acids（IF：8.886）的文章對(duì)構(gòu)建了基于 m6A 的 lncRNA 的風(fēng)險(xiǎn)模型，用于預(yù)測(cè)肺腺癌患者的預(yù)后和免疫治療效果。
研究思路：
1、獲取數(shù)據(jù)。從TCGA數(shù)據(jù)集中提取了 14,142 個(gè) lncRNA 和 21 個(gè) m6A 基因的表達(dá)譜。
2、探索數(shù)據(jù)。采用Pearson 相關(guān)分析繪制相關(guān)圖以鑒定了 m6A 相關(guān)的 lncRNA，得到1149個(gè)m6A相關(guān)IncRNA。最后桑基圖可視化用以描述m6A-lncRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。
3、構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型。
3.1 變量篩選。采用單變量Cox回歸分析從TCGA數(shù)據(jù)集中1149個(gè)m6A相關(guān)IncRNA中篩選出38個(gè)m6A相關(guān)預(yù)后lncRNA，緊接著采用LASSO-penalized Cox 分析進(jìn)一步篩選，篩選出24個(gè)m6A相關(guān)的lncRNA。
3.2 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型。 使用多變量 Cox 比率風(fēng)險(xiǎn)回歸分析來(lái)區(qū)分自發(fā)性預(yù)后蛋白。12 種 m6A 相關(guān) lncRNA 是與訓(xùn)練集中的 OS 獨(dú)立相關(guān)的預(yù)后蛋白，用于構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型以評(píng)估 LUAD 患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。
3.3 風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)。根據(jù)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的中值，將 LUAD 樣本分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。繪制兩個(gè)不同風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存狀態(tài)和生存時(shí)間，并采用熱圖進(jìn)行聚類分析顯示了每個(gè)患者的 12 個(gè)預(yù)后 lncRNA。
3.4 驗(yàn)證模型的預(yù)后能力。獲取外部數(shù)據(jù)，分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，訓(xùn)練集用以構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，對(duì)于測(cè)試集進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析，以驗(yàn)證與訓(xùn)練集結(jié)果是否存在差異，與此同時(shí)，為進(jìn)一步預(yù)測(cè)預(yù)后模型的能力，探索了無(wú)病間隔（DFI）、無(wú)進(jìn)展間隔（PFI）和疾病特異性生存（DSS）以區(qū)分高危和低危 LUAD 患者。
3.5 驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)模型分組能力。采用PCA基于整個(gè)基因表達(dá)譜、21個(gè)m6A基因、12個(gè)m6A相關(guān)lncRNA以及根據(jù)12個(gè)m6A相關(guān)lncRNA的表達(dá)譜分類的風(fēng)險(xiǎn)模型，測(cè)試低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異。
4、驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)模型的臨床效果。
4.1 驗(yàn)證兩個(gè)分組在免疫指標(biāo)的表達(dá)。基于m6A 相關(guān) lncRNA 模型分別對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組分析在免疫指標(biāo)的表達(dá)受否差異。
4.2 用基因本體 (GO) 富集分析探索基于 m6A 的模型的潛在分子機(jī)制。
4.3 研究了 m6A 相關(guān)的 lncRNA 模型與免疫治療生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性。
4.4 對(duì)突變數(shù)據(jù)根據(jù)變異效應(yīng)預(yù)測(cè)因子對(duì)突變進(jìn)行分層。測(cè)試了 m6A 相關(guān)的 lncRNA 模型相比于 TP53 突變狀態(tài)的預(yù)后效果。
5、鑒定風(fēng)險(xiǎn)模型治療LUAD 患者的潛在藥物。
使用pRRophetic 算法根據(jù)每個(gè)樣本的癌癥藥物敏感性基因組學(xué) (GDSC) 數(shù)據(jù)庫(kù)中可用的半數(shù)最大抑制濃度 (IC50) 來(lái)估計(jì)治療反應(yīng)。
6、構(gòu)建并評(píng)估預(yù)后列線圖模型將模型結(jié)果可視化。
整篇文章作者針對(duì)LUAD 患者，輔助m6A+ IncRNA+免疫治療的研究，癌癥+m6A+免疫治療幾大熱門領(lǐng)域，構(gòu)建m6A相關(guān)IncRNA風(fēng)險(xiǎn)模型，操作簡(jiǎn)單容易復(fù)現(xiàn)，再加上嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)論證，發(fā)表高分文章自然水到渠成。
總結(jié)
以上是m6A的基本研究思路，再加上嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)論證，要想發(fā)表文章自然水到渠成，當(dāng)然其中還需要明確細(xì)化更多的問(wèn)題。
