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今天給大家介紹一篇發表在Hepatology Communications（IF: 5.073）上的單細胞轉錄組和單細胞核轉錄組相結合的文章。
scRNA-seq、snRNA-seq和空間轉錄組鑒定人類肝臟的膽管細胞和間充質異質性
背景介紹
肝臟對人體新陳代謝和免疫功能至關重要。肝臟的基本結構和功能單位是肝小葉，肝小葉由實質細胞（主要是肝細胞）和非實質細胞組成，包括膽管細胞、肝竇內皮細胞 （LSEC）、肝星狀細胞 （HSC） 和免疫細胞。研究人員在2018年10月的時候在Nature Communication上發表過一篇題目為”Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations”的文章。他們利用10X scRNA-seq技術手段繪制了人類肝臟細胞圖譜，從來自五個人新鮮肝臟組織中分離得到的8444個實質和非實質細胞轉錄譜，鑒定出20個不同的細胞群，并確定了 20 個不同的細胞簇，包括兩個不同的具有免疫調節和炎癥特性的肝內巨噬細胞群。但這種方式存在著一定的缺陷，因為解離過程會對肝臟細胞造成一定的損傷，而且膽管細胞和肝間充質細胞如肝星狀細胞 (HSC)被檢測到的數量也很少。膽管細胞異質性的研究也是了解膽管病（例如原發性硬化性膽管炎）發病機制的關鍵。所以研究人員本次加入了單細胞核轉錄組測序技術（snRNA-seq）對四個健康人類肝臟樣本進行了測序分析。本研究揭示了應用于人類肝臟的 snRNA-seq 和 scRNA-seq 技術之間的細胞類型組成差異，以及特定于 snRNA-seq 數據的膽管細胞和肝臟間充質細胞亞群。
英文縮略詞
CV：central venous（中心靜脈）
FB：fibroblast（成纖維細胞）
HSC：hepatic stellate cell（肝星狀細胞）
IL：interleukin（白介素）
LSEC：liver sinusoidal endothelial cell（肝竇內皮細胞）
VSMC：vascular smooth muscle cell（血管平滑肌細胞）
研究內容和結果
一、數據質控和整合
1. scRNA-seq和snRNA-seq的組織樣本都是四個來自尾狀葉的人肝組織?？偣矎男迈r肝臟解離物中捕獲了29432個單細胞，從匹配的速凍組織中捕獲了 43863 個單核，都是10× Chromium平臺，并且都是相同的質控處理（圖1A）
2. 與scRNA-seq相比，snRNA-seq 捕獲了更多的基因（圖1B）。這些差異主要是由于 scRNA-seq 數據中含有大量的來自編碼核糖體蛋白的轉錄本和線粒體基因組中編碼的基因，而snRNA-seq數據中則不存在。
3. 由于存在系統差異，scRNA-seq和snRNA-seq的數據并不會聚在一起。通過對數據進行標準化和特征縮放，合并效果有所改善，但是兩種技術之間的差異仍非常顯著（圖1C）。于是研究人員通過Harmony這種算法來解決了這一問題，實現了scRNA-seq和snRNA-seq數據的整合和共聚類（圖1D）。
二、scRNA-seq與snRNA-seq揭示的人類肝臟細胞
1. 研究人員利用已知的標記基因對整合后的數據進行聚類和注釋（圖1E-G）。所得到的這些細胞類型在 scRNA-seq和snRNA-seq以及所有樣本中都存在，只是占比不同。特別是與僅捕獲了3%淋巴細胞和5%巨噬細胞的snRNA-seq相比，scRNA-seq捕獲了更高比例的免疫細胞（7%的淋巴細胞和9%的巨噬細胞）。值得注意的是，snRNA-seq比scRNA-seq捕獲到了更多的膽管細胞和肝間充質細胞（圖1F）。
2. 肝細胞是肝小葉的主要實質細胞，負責大部分肝功能。它們表現出從中央靜脈到門靜脈周圍區域的功能分區。通過對肝細胞群進行亞聚類可以得到六個不同的亞群（圖2A-B）。這些亞群在scRNA-seq和snRNA-seq以及不同的樣本中都存在（圖2C-D）。將這些亞群與已報道的小鼠肝小葉顯微解剖區域的分區表達相關聯，可以將這些亞群中的三個注釋為包含中央周圍或門靜脈周圍肝細胞的亞群（圖2E）；同時研究人員通過觀察已知標記基因（如CYP3A4、ADH4、GLUL和HAL等基因）在整合后的數據集中的肝細胞亞群中的表達情況進一步驗證了上述注釋的可靠性（圖2F）。在其余三個亞群中，IZ1和IZ2這兩個亞群代表著人類帶間肝細胞（圖2E）。進一步對這兩個亞群的標記基因在空間轉錄組學和免疫組化層面進行驗證，它們表現出了與門靜脈周圍或中心周圍標記物明顯不同的表達模式（圖2G-I）。因為根據小鼠肝小葉解剖學分區標記基因有一類亞群并未被注釋到，所以研究人員推測剩下的一個亞群是人類特異性的帶間肝細胞亞群，但是還有待進一步驗證。
總體而言，不管是scRNA-seq還是snRNA-seq，都能很好的捕獲到肝細胞，但其中包含的細胞亞群的類型又存在一定的差異。例如根據富集結果顯示，更多的肝細胞相關的通路出現在snRNA-seq的數據中（圖J）。再如通過snRNA-seq在CV1肝細胞中鑒定的幾個重要基因未在scRNA-seq中鑒定出（圖2K），而門靜脈周圍肝細胞的基因表達模式在兩種技術中顯著相關（圖2L）。帶間肝細胞的差異比較大，其中許多在snRNA-seq中上調的基因在scRNA-seq中下調（圖 2M）。綜上所述，研究人員認為snRNA-seq更好的描述肝細胞特征。
3. 膽管細胞是排列在膽管內的上皮細胞，占總膽汁體積的 30%。研究人員之前通過scRNA-seq僅識別出很少的膽管細胞（約1.4%），在本研究中發現snRNA-seq可以捕獲更多的膽管細胞（約3.4%），產生總共 448 個膽管細胞樣細胞（圖 1G）。通過對這個細胞群進行進一步的分類，可以得到六個亞群，標記為Chol-1到Chol-6（圖3A）。分別注釋為三個ASGR1+肝細胞亞群、兩個典型的膽管細胞亞群和一組祖細胞亞群，其中 82%源自snRNA-seq（圖3B-F）。這些亞群不是特定出現于某些特定樣本中，表明它們不是批次效應或樣本異質性造成的（圖3D）。同時，這些亞群還形成了從雙能祖細胞延伸到肝細胞和膽管細胞命運擬時間線（圖3G）。接著研究人員進一步描述了這些亞群的特征，還進行了富集分析（圖3F）。為了證明這些被鑒定出的亞群的可靠性，研究人員還在他們2018年發表的scRNA-seq數據中進行的相關的注釋，結果發現這些細胞只能使用 snRNA-seq數據進行鑒定（圖3H-J）。
4. 各種肝間充質細胞群，如HSC、成纖維細胞 (FBs) 和血管平滑肌細胞 (VSMCs) 被認為是致病性肌成纖維細胞的來源，它們通過產生細胞外基質蛋白促進肝損傷后的纖維化。通過對這類細胞群再聚類可以發現這類細胞可以大致分為七個亞群（Mes1-7），其中只有Mes4這類亞群被兩種方法捕獲的細胞大致相同，其余亞群大部分來自于snRNA-seq（圖4A-D）。通過對各類亞群的特征描述和通路富集分析發現，使用snRNA-seq技術可以發現存在于健康肝臟中數量較少的細胞群，如VSMCs和FBs（圖4）。
5. 肝臟血管系統的內皮由 LSEC 和血管內皮細胞組成（圖5A），與肝細胞類似，LSEC這類細胞也在snRNA-seq中捕獲更多（圖B-D）。這些亞群的標記基因和富集通路在兩種技術中基本一致，但snRNA-seq中基因表達變化要更?。▓D5F-I）。
6. 研究人員最后還對肝內免疫相關細胞進行了描述。首先是肝內單核細胞和巨噬細胞。結果發現，snRNA-seq中巨噬細胞的總體比例較高，但snRNA-seq中炎性巨噬細胞的相對比例較低（圖6A-D）。雖然snRNA-seq在捕獲非炎性巨噬細胞及其相關標記基因的表達變化方面效果要更好（圖6B、E），但是scRNA-seq的效果其實也不差，而且描述炎性巨噬細胞的效果要更顯著（圖6F）。免疫相關通路在snRNA-seq中表達比scRNA-seq 更高（圖6G），表明巨噬細胞可能對解離敏感。
7. 最后是肝內淋巴細胞，scRNA-seq的效果明顯優于snRNA-seq（圖7）?？梢杂^察到淋巴細胞在snRNA-seq中被捕獲到的數量明顯低于scRNA-seq。
小結
這篇文章通過比較scRNA-seq和snRNA-seq兩種技術所得到的數據，揭示了肝臟中主要的細胞分類和特征，描述了這兩種技術之間的差異，為不同研究方向采用什么樣的技術提供了思路。同時也給讀者展示了如果只有正常樣本數據又該怎樣講故事。其中富集通路圖的繪制還是值得借鑒的。
參考文獻
Andrews TS, Atif J, Liu JC, Perciani CT, Ma XZ, Thoeni C, Slyper M, Eraslan G, Segerstolpe A, Manuel J, Chung S, Winter E, Cirlan I, Khuu N, Fischer S, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, McGilvray ID, Bader GD, MacParland SA. Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity. Hepatol Commun. 2021 Nov 18.
