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Molecular Mechanisms of Long Noncoding RNAs
LncRNA的分子機(jī)制
上個(gè)星期，青山與師兄聊到ceRNA網(wǎng)絡(luò)的生信文章也屢見不鮮了，師兄聽后，默默說(shuō)了一句 “不是文章套路不新鮮了，是大家對(duì)lncRNA的了解在ceRNA就到頭了。“
我頓時(shí)發(fā)現(xiàn)，自己對(duì)lncRNA的了解也十分有限，脫離本質(zhì)，只依靠分析方法，去解釋lncRNA在疾病中的機(jī)制實(shí)在是太膚淺，所以趕緊找來(lái)這篇綜述學(xué)習(xí)。同時(shí)，青山也將這篇綜述分享給大家。
正文開始之前，先不直接解釋LncRNA的定義，首先他也是一種RNA，和mRNA有什么區(qū)別的呢？mRNA和DNA到底是什么呢？和人體的生長(zhǎng)發(fā)育又有什么聯(lián)系呢？種種問題使我不僅好奇起來(lái)，那么，讓青山帶大家一起探索這個(gè)既耳熟能詳，又不知從何說(shuō)起的大自然神奇造物。
細(xì)胞中的生物大分子有四種，分別是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和核酸。蛋白質(zhì)是細(xì)胞生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，基本單位是氨基酸。脂質(zhì)包括脂肪、磷脂和固醇三種，其中脂肪是細(xì)胞內(nèi)的主要儲(chǔ)能物質(zhì)，磷脂是生物膜的重要組成成分，固醇包括膽固醇、性激素和維生素D三種。糖類是細(xì)胞內(nèi)的主要能源物質(zhì)。核酸是生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)，包括脫氧核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩種。
在基因組中，遺傳信息存儲(chǔ)在稱為基因的DNA序列中，基因是含有能夠影響生物體表型特征的遺傳信息的DNA序列。基因內(nèi)的DNA堿基序列作為模板可以合成RNA分子，在大多數(shù)情況下，RNA分子被翻譯成多肽，折疊為蛋白質(zhì)。 將基因的核苷酸序列復(fù)制到RNA鏈中的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄。
人體一個(gè)細(xì)胞含RNA約10pg（含DNA約7pg）。與DNA相比，RNA種類繁多，分子量較小，含量變化大。RNA可根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同分為信使RNA和非編碼RNA。非編碼RNA分為非編碼大RNA和非編碼小RNA。非編碼大RNA包括核糖體RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA。非編碼小RNA包括轉(zhuǎn)移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA（20~300nt）包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等。真核生物90%的RNA分布在細(xì)胞質(zhì)中，少量存在于線粒體和核仁。
首先簡(jiǎn)要概括mRNA的特點(diǎn)，mRNA只占細(xì)胞總RNA的2%~5%，但種類最多，并且代謝十分活躍，是半衰期最短的一種RNA，合成后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)即被分解。真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A）尾巴。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
一、lncRNA概述
從原核生物到真核生物，非編碼RNA隨著生物體級(jí)別的增高，其在細(xì)胞的含量也逐漸升高，相較于只有2%的mRNA，人類細(xì)胞含有約98.5%的非編碼RNA。這提示隨著基因組復(fù)雜程度和生物體內(nèi)智能化程度越來(lái)越高，非編碼RNA的功能也隨之增加。從長(zhǎng)度對(duì)比，哺乳動(dòng)物mRNA長(zhǎng)度為5×102~1×105nt，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA) 是長(zhǎng)度大于 200 個(gè)nt的非編碼 RNA。
LncRNA的功能
lncRNA可以作為主要研究分子的原因，就是lncRNA可以在不同的水平（表觀遺傳學(xué)-染色質(zhì)重構(gòu)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后加工）調(diào)控編碼蛋白的mRNA的表達(dá)[1,2]。
lncRNA可通過(guò)招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物至特定的基因組位點(diǎn)使其發(fā)生催化活性。如圖3a，HOTAIR、Xist/RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位點(diǎn)，使得X染色體或Kcnq1功能域的組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生3甲基化（me3K27），誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成，從而抑制該區(qū)域基因表達(dá)。
lncRNA可通過(guò)多種機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，包括自身作為共調(diào)節(jié)因子、修飾轉(zhuǎn)錄因子活性、調(diào)節(jié)共調(diào)節(jié)因子的結(jié)合和活性等。lncRNA靶向基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的不同環(huán)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄激活因子、阻遏蛋白，包括RNA聚合酶II、甚至DNA雙鏈在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成分來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。這些lncRNA可能形成一個(gè)包括轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在復(fù)雜的真核生物中精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)。如圖3b，lncRNA結(jié)合到基因cyclin D1上，招募RNA結(jié)合蛋白TLS來(lái)調(diào)控蛋白CBP和p300的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)而抑制cyclin D1轉(zhuǎn)錄；圖3c，超保守增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄出lncRNA-Evf2，該lncRNA能激活轉(zhuǎn)錄因子DLX2，進(jìn)而調(diào)控基因Dlx6轉(zhuǎn)錄；圖3d，DHFR次要啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄出的lncRNA與該基因主要啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合形成三聚體，抑制轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合，從而使基因DHFR發(fā)生沉默。
互補(bǔ)的lncRNA與mRNA形成RNA雙鏈體可掩蓋mRNA內(nèi)部與反式作用因子結(jié)合必須的主要元件，可能影響轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的任何步驟，包括pre-mRNA的加工、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、降解。圖3e中，反義lncRNA與剪接體（splicesome）中鋅指同源mRNA Zeb2的5'剪切位點(diǎn)結(jié)合，使內(nèi)含子未被剪切掉，而該內(nèi)含子序列中保留有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRE位點(diǎn)），翻譯過(guò)程中識(shí)別并結(jié)合該位點(diǎn)，導(dǎo)致Zeb2基因表達(dá)和翻譯。
羅列定義是很抽象不好理解的，Mercer[3]總結(jié)了8個(gè)lncRNA調(diào)控mRNA表達(dá)的具體機(jī)制（圖4）：
1.編碼蛋白的基因上游啟動(dòng)子區(qū)（橙色）轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因（藍(lán)色）的表達(dá)；
2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因（藍(lán)色）的表達(dá)；
3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫色），干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；
4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫色），在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA； 5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本（綠色）可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；
6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；
7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的細(xì)胞定位；
8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。
探索非編碼RNA的種類
在Chris P[4]的文章中，非編碼RNA的來(lái)源有多個(gè)途徑，可以由編碼蛋白質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生中斷而轉(zhuǎn)變成非編碼RNA；也可通過(guò)染色質(zhì)重排，生成含多個(gè)外顯子的非編碼RNA；另外，非編碼基因通過(guò)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座作用復(fù)制，產(chǎn)生有功能的非編碼反義基因以及沒有功能的非編碼反轉(zhuǎn)錄假基因；再者，非編碼RNA內(nèi)部某段序列的重復(fù)復(fù)制，產(chǎn)生了新的具有相鄰重復(fù)序列的非編碼RNA；轉(zhuǎn)座元件插入基因組中，也可產(chǎn)生一個(gè)有功能的編碼RNA。
Massively parallel cDNA sequencing，也就是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)，測(cè)序的結(jié)果主要依賴于現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄本注釋，基于現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄本分析基因的表達(dá)水平和變異。Mitchell[5]提出了一種重建哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)，Scripture。Mitchell通過(guò)對(duì)小鼠的胚胎干細(xì)胞測(cè)序，重新堅(jiān)定了小鼠胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，在已知的編碼RNA基因序列間發(fā)現(xiàn)了大量的未知區(qū)域，包括了上千個(gè)新的5 '起始位點(diǎn)，3 '末端和內(nèi)部編碼外顯子。Mitchell利用Scripture測(cè)序技術(shù)，鑒定了超過(guò)1000個(gè)大型基因間非編碼RNA (lincRNA)和反義位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)。目前除了少數(shù)lncRNA的功能比較明確外，大部分lncRNA的功能都還未知。非常值得去深入研究。（圖6）
根據(jù)基因組上的位置關(guān)系，lncRNA主要可以分為以下三大類[6]（圖7所示）：1、Intronic lncRNA，內(nèi)含子lncRNA：主要產(chǎn)生于編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域；2、Intergenic lncRNA，基因間區(qū)的lncRNA，也稱作lincRNA：主要產(chǎn)生于兩個(gè)編碼基因的中間區(qū)域；3、Antisense lncRNA，反義lncRNA：主要產(chǎn)生于編碼基因的反義鏈。進(jìn)一步根據(jù)基因組位置還可細(xì)分為下面的類型[7]（圖8）：
LncRNA的種類及在基因組的未知如此繁雜，注釋起來(lái)也相對(duì)困難，目前保存lncRNA信息的數(shù)據(jù)庫(kù)達(dá)十余種（不是我們生信分析預(yù)測(cè)mRNA的那種數(shù)據(jù)庫(kù)），但不同數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的lncRNA完整性和覆蓋度不大一樣。就這樣看，是不是覺得目前的生信分析，還是很局限呢？那些叫囂著生信已經(jīng)玩爛的人，可能要重新審視一下lncRNA的潛力。
從Antisense lncRNA為例，展開對(duì)lncRNA功能的分析，在不改變基因核苷酸序列的情況下，antisense lncRNA能夠結(jié)合DNA進(jìn)行甲基化酶及染色質(zhì)組蛋白修飾酶的招募，通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)，調(diào)控正義基因的表達(dá)，并且產(chǎn)生可遺傳變異。像這種修飾可以小到作用于一個(gè)基因，大到影響整個(gè)染色體，比如Xist和反義Tsix二者介導(dǎo)的X染色體失活過(guò)程（圖9）。
由于哺乳動(dòng)物雌性含有兩條X染色體，而雄性只有一條X染色體，為了確保雄性(XY)和雌性(XX)的X基因劑量相等，雌性胚胎會(huì)發(fā)生單個(gè)X染色體永久失活，即“劑量補(bǔ)償”效應(yīng)。非編碼RNA Xist是X染色體失活的主要參與基因，Xist僅在失活的X染色體中表達(dá)，其通過(guò)包裹合成它的X染色體，并結(jié)合Eed/PRC2復(fù)合物形成H3K27me3組蛋白修飾，進(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄，致使X染色體失活。而在Xist基因3'端存在antisense lncRNA Tsix，Tsix的轉(zhuǎn)錄可以阻止Eed/PRC2募集到Xist啟動(dòng)子區(qū)并且抑制H3K4甲基化，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終沉默Xist。
由于antisense lncRNA和正義鏈基因方向相反，單單從空間位置來(lái)說(shuō)，有模型表明當(dāng)正/反義鏈同時(shí)轉(zhuǎn)錄形成RNA時(shí)，RNA聚合酶會(huì)相遇產(chǎn)生一定的空間阻礙，從而使RNA的轉(zhuǎn)錄受到抑制，像這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控是由于基因本身方向相反導(dǎo)致，并不是由antisense lncRNA本身的調(diào)控功能引起對(duì)正義鏈基因轉(zhuǎn)錄的影響。
在細(xì)胞核內(nèi)，antisense lncRNA能夠與正義鏈RNA通過(guò)堿基配對(duì)形成二聚體，二聚體的形成會(huì)導(dǎo)致部分外顯子的剪接位點(diǎn)被掩蓋掉，從而影響前體pre-mRNA的剪切過(guò)程，產(chǎn)生不同種類的mRNA成熟體。研究表明，antisense lncRNA除了通過(guò)二聚體形式調(diào)控pre-mRNA的成熟剪切，它也可以對(duì)核內(nèi)mRNA的部分核苷酸進(jìn)行替換編輯，如果蠅的反義Sas-10通過(guò)結(jié)合Rnp4f，將Rnp4f部分腺嘌呤替換為次黃嘌呤，從而降低Rnp4f mRNA的表達(dá)水平。
Antisense lncRNA不只在細(xì)胞核內(nèi)影響正義基因的轉(zhuǎn)錄，正/反義鏈RNA二聚體同樣能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。Antisense lncRNA可以結(jié)合正義基因mRNA 3’ UTR區(qū)，封閉大量miRNA的靶位點(diǎn)，阻礙了miRNA對(duì)靶基因的抑制作用，從而維持mRNA的穩(wěn)定性。如反義lncRNA-PXN-AS1-L能夠結(jié)合PXN mRNA 3’ UTR，提高PXN mRNA的穩(wěn)定性，最終促進(jìn)癌基因RXN的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)3。 Antisense lncRNA同樣能夠吸附miRNA，進(jìn)而減弱miRNA對(duì)靶基因的下調(diào)。另外，antisense lncRNA可與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本，形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生類似內(nèi)源性的siRNA，從而沉默編碼基因的表達(dá)。下面讓我們開始解讀正文。
重點(diǎn)定義：
*等位基因：人的眼瞼形態(tài)是一種性狀，這種性狀有不同的表現(xiàn)形式：雙眼皮、單眼皮，其中單為隱性，雙為顯性。我們把它們稱為相對(duì)性狀。性狀又是由基因控制的，控制顯性性狀的為顯性基因（用大寫字母，如A），控制隱性性狀的為隱性基因（用小寫字母，如a）。基因在體細(xì)胞中成對(duì)存在，所以一個(gè)個(gè)體的基因型就有：AA，Aa，aa。A和a就可以表示一對(duì)等位基因，即染色體的相同位置上控制相對(duì)性狀的一對(duì)基因。
*基因座：基因座是染色體上的固定部位，在相同基因座上編碼相同的DNA被稱為等位基因。形象地說(shuō)，一對(duì)染色體可想象為兩條平行線，染色體上一個(gè)給定的位置，好比兩平行線上相對(duì)應(yīng)位置的一點(diǎn)或一段，叫做基因座。
*順式作用：同一染色體上DNA序列直接調(diào)控其鄰近基因的表達(dá)，例如，DNA對(duì)DNA。由某一基因表達(dá)后，對(duì)自身基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用；調(diào)節(jié)因子是與被調(diào)節(jié)基因同處于一條DNA鏈上的另一端DNA片段而進(jìn)行的調(diào)節(jié)。
*順式作用元件：順式作用元件（cis-acting element）存在于基因旁側(cè)序列中，能影響基因表達(dá)的序列。順式作用元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，它們的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控。順式作用元件本身不編碼任何蛋白質(zhì)，僅僅提供一個(gè)作用位點(diǎn)，要與反式作用因子相互作用而起作用。
*順式or反式：在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，相對(duì)同一染色體或DNA分子而言為“順式”（cis）；對(duì)不同染色體或DNA分子而言為“反式”（trans）。
*印記基因：指來(lái)自父or母方的，親本來(lái)源的同源基因表達(dá)，而來(lái)自另方的不表達(dá)，因?yàn)閬?lái)自父方和母方的等位基因在通過(guò)精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生了修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達(dá)特性，這種修飾常為DNA甲基化修飾，也包括組蛋白乙酰化、甲基化等修飾。
*印記基因的修飾：在生殖細(xì)胞形成早期，來(lái)自父方和母方的印記將全部被消除，父方等位基因在精母細(xì)胞形成精子時(shí)產(chǎn)生新的甲基化模式，但在受精時(shí)這種甲基化模式還將發(fā)生改變；母方等位基因甲基化模式在卵子發(fā)生時(shí)形成，因此，在受精前來(lái)自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式，在成卵子后會(huì)有不用的基因表達(dá)模式。
二、 原型Ⅰ：信號(hào)（Archetype I: Signals）
等位基因特異性：Xist
Xist lncRNA與X染色體失活
X染色體去激活，又稱X染色體失活或里昂化，是指雌性哺乳類細(xì)胞中兩條X染色體的其中之一失去活性的現(xiàn)象[8]。正常的雌性擁有兩條X染色體，有一條保有活性，標(biāo)記作Xa；另一條則失活，標(biāo)記作Xi。目前的假說(shuō)認(rèn)為，體染色體上有某個(gè)基因會(huì)制造出“阻礙因子”（blocking factor）來(lái)與X染色體結(jié)合，進(jìn)而防止此染色體失去活性。X染色體上存在一種稱為X去活化中心（X inactivation center，XIC）的序列，可調(diào)控X染色體的沉默化，是阻礙因子可能的結(jié)合位置。這些XIC序列是造成X染色體去活化的充要條件。
XIC序列上含有兩個(gè)非轉(zhuǎn)譯RNA基因，分別是Xist與Tsix，此兩者參與了去活化作用。此外，XIC上含有一些結(jié)合位置，分別可供一些已知和未知調(diào)控蛋白（regulatory protein）結(jié)合。Xist基因會(huì)轉(zhuǎn)錄出RNA分子，且此RNA將不會(huì)轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，XistRNA會(huì)從XIC位置開始，逐漸將Xi包覆起來(lái)，而且這些XistRNA并不會(huì)作用到Xa上。Xi被RNA包覆過(guò)后不久就會(huì)發(fā)生基因沉默現(xiàn)象。Xist是X染色體去活化的主要影響因子，Xi染色體外圍會(huì)被XistRNA包覆，而Xa則沒有這種現(xiàn)象。缺乏Xist基因的X染色體將無(wú)法去活化。
另一方面，Tsix基因同樣也會(huì)轉(zhuǎn)錄出一條無(wú)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的RNA分子。Tsix基因是Xist基因的反義序列，也就是說(shuō)，兩者實(shí)際上是來(lái)自同一段DNA上互補(bǔ)的兩股，而他們的產(chǎn)物RNA也因此具有互補(bǔ)性。這使Tsix成為Xist的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，使沒有表現(xiàn)Tsix的X染色體比較容易被去活化。
*知識(shí)點(diǎn)拓展：2021年3月17日，來(lái)自斯坦福大學(xué)Howard Chang教授團(tuán)隊(duì)在Cell上發(fā)表論文B cell-specific XIST complex enforces X-inactivation and restrains atypical B cells。本文首次報(bào)道了XIST在成體免疫B細(xì)胞中維持X染色體失活的重要作用和調(diào)控機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了領(lǐng)域之前對(duì)XIST在成體體細(xì)胞中X失活作用的認(rèn)識(shí)，拓寬了lncRNA-蛋白復(fù)合物的細(xì)胞特異性功能，揭示了X失活對(duì)免疫反應(yīng)兩性差異的重要影響。
表達(dá)趨勢(shì)與器官生長(zhǎng)有關(guān)：HOTAIR和HOTTIP
HOX基因座的ncRNA
Hox基因，全名同源基因（homeotic genes）或同源異型基因。是生物體中一類專門調(diào)控生物形體的基因，一旦這些基因發(fā)生突變，就會(huì)使身體的一部分變形。其作用機(jī)制，主要是調(diào)控其他有關(guān)于細(xì)胞分裂、紡錘體方向。Hox基因?qū)儆谕串愋秃校╤omeobox）家族的其中一員，在大多數(shù)Hox基因中，會(huì)含有一段約180個(gè)核苷酸的同源異型盒，可以轉(zhuǎn)錄出含有約60個(gè)氨基酸序列，稱為同源蛋白質(zhì)區(qū)段（homeodomain）。各種生物的Hox基因之表現(xiàn)方式類似，靠近3'端的基因會(huì)表現(xiàn)于動(dòng)物的身體前部，靠近5'端則表現(xiàn)于身體的后部。除了這種規(guī)律之外，Hox基因又會(huì)因?yàn)橐恍┰颍诓煌瑺顟B(tài)下有不同的表現(xiàn)。
人類的Hox基因可分成4個(gè)基因群集，分別位在不同的染色體上，這些染色體分別是7號(hào)、17號(hào)、12號(hào)與2號(hào)。人類的Hox基因在書寫時(shí)以全大寫表達(dá)，例如HOXA、HOXB、HOXC與HOXD。此外，這些基因可分成13個(gè)平行同源家族（paralogous family），以數(shù)字表示，例如HOXA4，HOXB4，HOXC4與HOXD4。這些家族成員的DNA序列與轉(zhuǎn)錄出來(lái)的蛋白質(zhì)序列類似。其中HOXD13的突變會(huì)造成多指癥（synpolydactyly）；而HOXA13的突變則會(huì)導(dǎo)致手腳生殖器癥（hand-foot-genital syndrome，HGFS）。另外HOXB群集中的8個(gè)成員會(huì)影響紅血球的發(fā)育，其中HOXB4與HOXB7又會(huì)影響T細(xì)胞與B細(xì)胞。
大量的lncRNA被發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄于人類HOX基因簇中，它們以時(shí)間和空間特異的方式表達(dá)。lncRNA也被發(fā)現(xiàn)與HOX基因座的整體空間表達(dá)模式相對(duì)應(yīng)，表明它們可能使用與HOX基因相同的增強(qiáng)子，例如，HOTAIR，一個(gè)HOXC基因座的lncRNA，在遠(yuǎn)端和后端位置相同的細(xì)胞中表達(dá)；以及Frigidair，另一個(gè)HOXC基因座的lncRNA，具有前端的表達(dá)模式。相反，HOTTIP，另一個(gè)在人HOXA簇遠(yuǎn)端發(fā)現(xiàn)的lncRNA，也在遠(yuǎn)端細(xì)胞中表達(dá)[9]。（圖14）
知識(shí)點(diǎn)拓展：HOX基因在喉癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)譜研究[10]（生信分析）
DNA損傷誘導(dǎo)：LincRNA-p21和PANDA
LncRNA不僅影響生物發(fā)育，而且在組織應(yīng)激時(shí)（炎癥、腫瘤）也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-p21位于CDKN1A基因上游，參與調(diào)控p53介導(dǎo)的凋亡過(guò)程。
lincRNA-p21 由 p53 直接激活，與異質(zhì)性核糖核蛋白K（hnRNP-K） 這個(gè)反式作用因子直接相互作用來(lái)共同調(diào)控細(xì)胞凋亡[11]。（圖15）
lncRNA-PANDA也依賴p53基因的激活。在缺乏p53基因的情況下，PANDA不能被DNA損傷激活。在DNA損傷后，p53直接與CDKN1A位點(diǎn)結(jié)合并激活PANDA。PANDA隨后與轉(zhuǎn)錄因子NF-YA相互作用，限制促凋亡基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯[12]。
多能性與重編程：ROR-LncRNA
提到多能性和重編程，大家一定能聯(lián)想到誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）。2006年日本京都大學(xué)Shinya Yamanaka在世界著名學(xué)術(shù)雜志《細(xì)胞》上率先報(bào)道了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究。他們把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。
科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）中存在一種與細(xì)胞多能性相關(guān)的lincRNA-ROR。研究人員表明，重編程可以誘導(dǎo)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞（iPSC）。lincRNA-RoR參與了體細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)化為多能性干細(xì)胞的過(guò)程。ROR是關(guān)鍵的多潛能因子Oct4、Sox2和Nanog的直接靶向因子，研究發(fā)現(xiàn)RoR在Oct4缺失時(shí)下調(diào)，在iPSC分化過(guò)程中也下調(diào)[13]。
冷誘導(dǎo)：COLDAIR和COOLAIR
本篇綜述，作者也舉了植物相關(guān)的lncRNA參與的分子機(jī)制。對(duì)植物來(lái)說(shuō)，從營(yíng)養(yǎng)發(fā)育到生殖發(fā)育的轉(zhuǎn)變是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過(guò)程。許多植物對(duì)季節(jié)非常敏感，利用春化作用儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)，在一年中的最佳時(shí)期開始開花。冬季寒冷的環(huán)境中會(huì)通過(guò)表觀遺傳沉默機(jī)制，激活抑制開花的因子，為春季開花提供能力。例如在擬南芥植物中，寒冷引起開花因子沉默的過(guò)程中，產(chǎn)生了大量的反義轉(zhuǎn)錄本，其中一種lncRNA，命名為COOLAIR，溫度下降激活lncRNA-COOLAIR與PRC2形成復(fù)合物，導(dǎo)致花抑制因子-開花位點(diǎn)C（FLC）染色質(zhì)上三甲基化組蛋白H3K27的富集，達(dá)到FLC的表觀遺傳穩(wěn)定的抑制作用。
以eRNA為例的協(xié)調(diào)活性
在發(fā)育和分化過(guò)程中，基因的表達(dá)調(diào)控涉及許多元件，例如，順式調(diào)控DNA元件和反式作用蛋白。順式調(diào)控DNA元件有啟動(dòng)子，絕緣子，增強(qiáng)子和沉默子。其中，一類被稱為增強(qiáng)子RNA（eRNA），也是一種lncRNA，eRNA的長(zhǎng)度為0.5-5kb。
啟動(dòng)子位于基因近端，與一般轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)聯(lián)，招募和定位RNA聚合酶激活轉(zhuǎn)錄。與啟動(dòng)子相反，增強(qiáng)子eRNA通常遠(yuǎn)離它們所調(diào)控的基因。是一類DNA調(diào)節(jié)序列，其可以激活基因表達(dá)而不依賴于它們與其靶基因的距離或方向。增強(qiáng)子通常與靶基因結(jié)合。在發(fā)育過(guò)程中，按時(shí)間及組織特異性調(diào)控編碼基因的表達(dá)。它們的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)會(huì)誘發(fā)人類疾病。研究報(bào)道，eRNA的改變可影響癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)等生物過(guò)程，是潛在的治療靶點(diǎn)。目前估計(jì)> 400k潛在的增強(qiáng)子存在于人類基因組中[14]。
重復(fù)檢測(cè)：RNA降解和Staufen
mRNA的豐度與蛋白質(zhì)的產(chǎn)量由直接的聯(lián)系。影響mRNA豐度的主要因素就是轉(zhuǎn)錄量和降解速率。mRNA的轉(zhuǎn)錄量和降解速率主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后加工決定。RNA結(jié)合蛋白Staul（Staufenl）通過(guò)直接結(jié)合移碼增加蛋白（up-fameshift protein 1，Upf1）的NMD因子，將其募集到mRNA的3‘-非編碼區(qū)域（UTR），引起mRNA的降解。這種機(jī)制稱為Staul介導(dǎo)的mRNA降解 (SMD)。一種稱為半Staul結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA，1/2-sbsRNA（half-STAU1結(jié)合位點(diǎn)lncRNA），通過(guò)與mRNA的3‘-非編碼區(qū)域（UTR）的ALU元件的不完全匹配，形成Staul結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)Staul與mRNA結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解[15,16]。
三、功能2：分子誘餌
上述研究結(jié)果證明lncRNA在調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄中的重要地位，此外，還有一個(gè)主要的機(jī)制，lncRNA充當(dāng)分子誘餌。吸引另外一個(gè)分子與它結(jié)合，并發(fā)揮功能。
DHFR次要啟動(dòng)子:DHFR Minor
二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是利用NADPH還原二氫葉酸產(chǎn)生四氫葉酸的氧化還原酶。DHFR次要啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄出的lncRNA與該基因主要啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合形成lncRNA-DNA復(fù)合體，抑制轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合，從而使基因DHFR發(fā)生沉默[13]，并強(qiáng)調(diào)了基因間的lncRNA在調(diào)控鄰近基因表達(dá)中充當(dāng)誘餌，結(jié)合某些物質(zhì)抑制基因表達(dá)。
TERRA：調(diào)控端粒
端粒是位于真核生物染色體物理末端的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，對(duì)染色體穩(wěn)定性至關(guān)重要。由端粒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈非編碼RNA被稱作TERRA， TERRA具有調(diào)控和保護(hù)染色體末端的能力[17]。研究報(bào)道，攜帶PolyA的TERRA，刺激端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞中的端粒酶重新募集，以及TERRA可作為支架，可以加強(qiáng)端粒上蛋白質(zhì) 招募和酶活性。
PANDA：NF-YA
lncRNA PANDA可以調(diào)控細(xì)胞凋亡。DNA損傷可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期停滯。PANDA對(duì)DNA損傷非常敏感，其表達(dá)的誘導(dǎo)早于CDKN1A。PANDA通過(guò)直接結(jié)合和分離NF-YA（一種在DNA損傷時(shí)激活凋亡程序的核轉(zhuǎn)錄因子）來(lái)抑制凋亡基因的表達(dá)，以利于細(xì)胞周期的停止。
Gas5：糖皮質(zhì)激素受體
生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest-special transcript 5, GAS5)屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA, 位于人類基因組1號(hào)染色體上, 在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物過(guò)程中起重要調(diào)控作用。研究表明Gas5具有誘導(dǎo)細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗的作用。Gas5通過(guò)形成RNA模體與糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合域結(jié)合，充當(dāng)分子誘餌，抑制糖皮質(zhì)激素受體[18]。
miRNA和剪接因子介導(dǎo)的LncRNA誘餌：假基因、miRNA靶向模擬物和MALAT1
miRNA可以與mRNA中的不完全互補(bǔ)序列相互作用調(diào)控編碼基因的表達(dá)。而lncRNA，腫瘤抑制因子假基因（PTENP1）的3’ UTR與以腫瘤抑制基因（PTEN）為靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)性miRNA序列結(jié)合，抑制PTEN基因的下調(diào)，并使其翻譯成腫瘤抑制蛋白PTEN。
總之，這些例子說(shuō)明了lncRNA誘餌可以結(jié)合蛋白質(zhì)和小的調(diào)節(jié)性RNA發(fā)揮作用。
四、功能III：引導(dǎo)
lncRNA的第三個(gè)功能是引導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，然后引導(dǎo)核糖核蛋白復(fù)合物定位到特定的靶點(diǎn)。lncRNA可以以順式（在鄰近基因上）或反式（遠(yuǎn)定位基因）的方式來(lái)引導(dǎo)基因表達(dá)的變化。
順式導(dǎo)向作用之一，前面也有提及，lncRNA具有類似啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的作用結(jié)合X染色體的非活性中心，使X染色體沉默[19]。（圖19）
起到反式導(dǎo)向作用的lncRNA，類似于轉(zhuǎn)錄因子一樣的結(jié)構(gòu)，可發(fā)揮反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用； 比如lncRNA HOTAIR與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR表達(dá)下降，細(xì)胞侵襲性下降，其中l(wèi)ncRNA HOTAIR對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響通過(guò)反式調(diào)控PRC2表達(dá)實(shí)現(xiàn)[20]。
五、功能IV：支架
TERC：組裝端粒酶
端粒酶催化活性需要與兩個(gè)端粒酶亞基的結(jié)合。TERC（端粒酶RNA）為合成端粒酶提供模板并且為端粒酶與催化蛋白的結(jié)合和催化活性提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[21]。
HOX基因座轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）：PRC2和LSD1
如前面所述，lncRNA HOTAIR結(jié)合多梳復(fù)合物PRC2，使K27上的組蛋白H3甲基化。發(fā)揮抑制基因表達(dá)的作用。研究報(bào)道與PRC2結(jié)合的片段是lncRNA HOTAIR 的5’ 端的前300nt，表明HOTAIR在PRC2和LSD1/CoREST/REST復(fù)合物之間充當(dāng)支架和橋梁。
INK4基因座反義非編碼RNA（ANRIL）：PRC2 and PRC1
INK4為細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑，INK4可與MDM2結(jié)合防止p53被泛素化降解，這兩種蛋白通過(guò)共同調(diào)節(jié)CDK4和p53，從而控制細(xì)胞從G1期轉(zhuǎn)到S期，是一個(gè)非常重要的抑癌基因。反義lncRNA-ANRIL，來(lái)源于INK4b/ARF/INK4a基因座，有類似于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的作用，ANRIL與多梳抑制復(fù)合物PRC2 and PRC1相結(jié)合，并通過(guò)與這兩種多梳蛋白相互作用引起INK4a基因轉(zhuǎn)錄沉默。
異染色質(zhì)：
lncRNA發(fā)揮異染色質(zhì)的分子拼接作用。異染色質(zhì)是指在細(xì)胞周期中具有固縮特性的染色體。異染色質(zhì)分為結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)和功能異染色質(zhì)兩種類型。結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是指各類細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)處于凝集狀態(tài)的染色質(zhì)，多定位于著絲粒區(qū)、端粒區(qū)，含有大量高度重復(fù)順序的脫氧核糖核酸（DNA），稱為衛(wèi)星DNA（satellite DNA）。功能異染色質(zhì)只在一定細(xì)胞類型或在生物一定發(fā)育階段凝集，如雌性哺乳動(dòng)物含一對(duì)X染色體，其中一條始終是常染色質(zhì)，但另一條在胚胎發(fā)育的第16～18天變?yōu)槟癄顟B(tài)的異染色質(zhì)，該條凝集的X染色體在間期形成染色深的顆粒，稱為巴氏小體（Barr body）。
總結(jié)
通過(guò)上述介紹的幾種lncRNA，可以說(shuō)lncRNA具備多種關(guān)鍵的生物學(xué)功能。目前發(fā)表的生信分析的文章，分析內(nèi)容主要涉及單個(gè)lncRNA在某些腫瘤中的預(yù)后作用，與臨床的相關(guān)性，通過(guò)一些lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)一些靶基因，再富集分析一下。進(jìn)階版本就是ceRNA網(wǎng)絡(luò)。但總的來(lái)講lncRNA與基因的作用不應(yīng)該限于作用于某個(gè)mRNA并調(diào)控mRNA的表達(dá)。也許，某些lncRNA本身異常的增高也是一種機(jī)制呢？希望由本篇綜述以及擴(kuò)展學(xué)習(xí)的資料，為大家增加一點(diǎn)關(guān)于生物信息的背景知識(shí)，再寫非編碼RNA的文章的時(shí)候，可以更進(jìn)一步的討論其與腫瘤的關(guān)系。
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