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腫瘤微環境是一個由多種細胞構成的復雜生態系統，包括癌細胞、免疫細胞和基質細胞，這些細胞之間的相互作用會共同維持腫瘤的發生發展。了解腫瘤微環境中的細胞表型，對了解癌癥進展和治療至關重要，單細胞測序技術的飛速發展也使人們能夠在更高分辨率下研究腫瘤微環境。生信人也介紹和分享了很多基于單細胞數據刻畫腫瘤微環境的文章，這些單細胞思路有的聚焦免疫細胞、有的關注成纖維細胞等基質細胞、有的會對整個腫瘤微環境進行刻畫。小編今天再和大家分享一篇今年六月剛剛發表在 Molecular Cancer（IF:41.444）雜志上的關于前列腺癌微環境中內皮細胞中關鍵基因的文章。文章結合組織及單細胞數據，生信與實驗結合，重點關注內皮細胞這單個細胞類型中的關鍵基因，并對這個基因的互作與功能進行了詳細刻畫。文章邏輯非常清晰，有理有據，簡潔易懂是一篇十分值得借鑒學習的高分文章。
Comprehensive characterization of the prostate tumor microenvironment identifes CXCR4/CXCL12 crosstalk as a novel antiangiogenic therapeutic target in prostate cancer
全面刻畫前列腺癌微環境識別CXCR4和CXCL1交互作為新的抗血管生成治療靶點
一．研究背景
腫瘤微環境(TME)在腫瘤的進展和治療調控過程中具有高度動態性和內在復雜性，研究已經發現腫瘤微環境中腫瘤細胞和基質細胞之間的相互作用會促進前列腺癌(PCa)的進展和擴散。因此，深入了解PCa腫瘤微環境(TME)改變過程中的細胞間通信網絡能夠促進新的治療策略開發。小編今天介紹的文章就對PCa的腫瘤內皮細胞(TEC)進行了詳細的刻畫，并解析了TEC和PCa TME之間的細胞交互。
二．文章摘要
文章對從67例根治性前列腺切除術(RP)標本中分離出的TEC進行了多組學體外刻畫，并通過免疫組化(IHC)和免疫熒光(IF)對TEC的功能和關鍵標志物進行了驗證。首先，為了識別TEC的細胞與細胞相互作用靶點，作者對4例接受RP的PCa患者進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)，以探索細胞內TME組成。接著作者通過免疫組化、公開數據集、細胞培養實驗以及PCa異種移植小鼠模型對靶點進行了驗證。結果RNA-seq分析發現與相鄰正常內皮細胞(NEC)相比，TEC中腫瘤血管、膠原修飾和細胞外基質重塑相關基因表達上調，這一結果在一個獨立患者隊列中被IF和IHC證實。此外，通過scRNA-seq，作者識別了27種細胞亞類，包括具有動脈、靜脈和未成熟信號的內皮細胞(EC)，以及血管生成EC。聚焦分子分析也發現與其他TME細胞亞群相比，動脈TEC顯示出CXCL12 mRNA水平升高，并與不良預后相關。
三．數據及方法
1. 生物實驗：作者使用根治性前列腺切除術(RP)獲得的活檢組織樣本分離內皮（EC），進行內皮細胞培養。后續也進行免疫熒光（IF）、免疫組化、細胞增殖、劃痕遷移實驗、細胞面積、細胞核面積、連接長度、定量RT-PCR及小鼠異種移植血管模型的分析。
2. RNA分析和測序：文章進行了組織和scRNA-seq測序。其中RNA-seq分析主要包括：1）數據預處理:作者使用STAR將組織RNA-seq讀取序列映射到人類基因組(GRCh38)，利用CellRanger軟件將scRNA-seq序列映射到人類基因組(GRCh38)，并使用UniApp平臺分析了原始、未篩選矩陣中的數據。2）質量控制及數據標準化：研究中組織 RNA-seq 數據使用EdgeR包進行標準化，scRNA-seq數據的質控包括: (i) 刪除表達小于三個細胞的基因； (ii) 過濾掉基因表達小于200或者大于8000以及線粒體基因表達大于20%的細胞。后續對保留細胞的表達數據進行標準化。
3. 細胞聚類及注釋：自動縮放后，作者對標準化數據進行主成分分析(PCA)，然后用t-SNE對前20個PCA進行可視化。接著使用Seurat對細胞進行高變基因篩選、標記識別及基于圖的聚類，并對細胞簇進行注釋。
4. 重新分析公開可用的轉錄組數據集：研究使用之前發表的meta分析的數據驗證CXCL12在小鼠的TEC和NEC中的表達情況。
5. TCGA隊列分析：作者下載了TCGA中前列腺腺癌(PRAD)隊列的表達及臨床數據，在表達及通路水平執行了生存分析及單因素cox分析。此外，作者也執行了GSVA分析評估樣本通路富集得分。
四．研究的主要內容及結果
1. 人前列腺組織TEC和NEC的分離、培養及識別
研究首先對從67例前列腺癌RP標本中分離出NEC和TEC進行純化并篩選EC標記CD31(圖1A)，并通過免疫細胞學檢測典型EC特征確定pca來源的TEC和NEC的內皮表型（圖1B）。接下作者通過細胞培養產生足夠的細胞數，并對NEC和TEC進行功能特征和組織 RNA-seq等全面分析。結果發現與NEC相比，前列腺TEC表現出細胞增殖和遷移增加(圖1C-D)。此外，前列腺TEC在形態學上也有改變，例如整個細胞的大小增加(圖1E)以及細胞核面積增加(圖1F)，不過兩種EC的細胞核與細胞的比例大小相似(圖1F- G)。此外，作者也在TEC中觀察到更多的不連續細胞連接(圖1H)。
2. RNA - Seq揭示前列腺TEC和NEC之間的差異
在文章第二部分作者對5例配對TEC和NEC樣本以及9例非配對樣本進行了組織 RNA-seq，以確定前列腺TEC和NEC之間的分子差異。通過差異基因表達分析，作者識別了TEC和NEC之間驅動的差異基因，并確定了將TEC和NEC分開的40個基因特征（圖2A）。接下來作者通過對EC相關基因進行基因集富集分析(GSEA)發現其與腫瘤血管系統相關（圖2B）。接著作者使用一個獨立的原發性PCa隊列對選定的TEC特征進行驗證（圖2C-E），結果發現與良性前列腺組織中的NEC相比，TEC中所有標記的表達水平均較高，其中包括與血管相關的CXCL12、PTGIR、PLAC9和VDR。此外，體外培養的TEC和NEC中進行的IF實驗也證實這一結果(圖2F)。這些結果表明培養的前列腺TEC保持了體內TEC的一些特征。
3. CXCL12是前列腺TEC標記物
由于培養的NEC和TEC之間的差異分析表明，CXCL12是上調最明顯的基因之一，且這一發現在培養的EC上得到了IF的證實(圖3A-B)。因此，在這一部分，作者對TCGA中422例PCa患者隊列的公開數據進行深入分析，結果發現CXCL12高表達與顯著較高的腫瘤復發率相關(圖3C)。接著為了確定CXCL12是否也在其他腫瘤類型的TEC中發生改變，作者使用了公開的TEC和NEC轉錄組學數據集，并分別對每個數據集進行了一項跨腫瘤的meta分析。結果發現CXCL12在大多數其他腫瘤實體中下調，但在培養的前列腺TEC中高度上調(圖3D)。
4. 前列腺TME的單細胞圖譜確定了產生CXCL12的細胞類型
在這一部分作者為了研究TEC標志物和CXCL12在全TME中的表達，對4例PCa患者的RP組織進行了scRNA-seq分析(圖4A)，并對保留的16529個高質量細胞進行了t-SNE可視化和聚類分析，結果識別到B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞和單核細胞、肥大細胞、上皮(和癌癥)細胞和成纖維細胞(圖4B-C)。接著作者通過對單個細胞群進行重聚類和注釋，發現總共有27個具有高度不同基因表達特征的亞群（圖4D-E）。作者也觀察到在不同患者之間，及在腫瘤和良性前列腺組織中，幾個亞群的分布存在差異(圖4F)。此外，作者識別了兩個高表達癌細胞標志物KLK3的上皮簇(圖5A)。作者也根據基因特征，將成纖維細胞分為常駐成纖維細胞和基質細胞（圖5B），而巨噬細胞和單核細胞則被細分為M1，M2型巨噬細胞、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、樹突狀細胞和na?ve以及激活的單核細胞（圖4D-E）。作者對M1和M2亞型巨噬細胞的差異分析也揭示了致癌M2表型的新標記以及CXCL12表達上調（圖5C）。
5. 刻畫腫瘤細胞內皮細胞亞群
在這一部分，作者對先前分析發現的表達動脈、靜脈、未成熟血管等細胞特征的4類腫瘤EC進行了分析（圖6A）。作者發現這些細胞群表達高度不同的標志物，其中一些已被IHC驗證(圖6A-B)。作者通過組織RNA-seq分析發現TEC標志物CXCL12在動脈EC中表達最高(圖6C)。通過NEC和TEC的差異分析，作者也發現CXCL12是動脈TEC中上調最高的基因之一(圖6D)。此外，作者發現IHC對CXCL12進行的蛋白水平驗證與單細胞分析一致，CXCL12在原發性PCa樣本的TEC中高度特異表達(圖6E)。最后，作者結合TCGA數據發現高表達動脈EC marker的患者預后更差(圖6F)。此外，靜脈和未成熟細胞的EC亞群特征基因也與不良預后相關(圖6G-I)。
6. 相互作用分析揭示CXCR4聯合CXCL12是候選的抗血管生成靶點
在文章這一部分，作者進一步評估了CXCL12在動脈EC中的表達，并與所有間質細胞進行了比較。結果作者發現與其他細胞類型相比，CXCL12在與血管生成相關的細胞亞型中顯著高表達(圖7A)，且腫瘤動脈EC表達CXCL12最高，血管生成表型也是如此(圖7A)。接著作者為了更好地理解動脈EC相關的CXCL12在PCa TME中的作用，使用CellPhoneDB進行互作分析(圖7 B)，結果發現在免疫細胞，中存在CXCL12到同源受體CXCR4的信號(圖7 B)，且與其他EC表型相比，尖端細胞高度過表達CXCR4(圖7C)。這些發現表明靶向CXCR4及CXCL12抑制血管生成可能是一個潛在的治療靶點。
7. 體外和體內CXCR4/CXCL12抑制PCa的功能驗證
在文章最后一部分，通過RT-PCR分析，作者發現與NEC相比，TEC中CXCL12及其同源受體CXCR4的表達上調(圖8A)，且CXCL12與CXCR4互作可以促進血管形成，而CXCR4拮抗劑可以抑制新生血管形成。由于發現CXCR4及CXCL12信號通路會在PCa TEC中觸發新生血管，作者驗證了CXCR4拮抗劑對TEC增殖能力的降低(圖8B)，以及細胞遷移的升高(圖8C)。接下來作者利用之前的一項小鼠研究，對血管進行了免疫組化，結果發現對照組小鼠的所有腫瘤均有CD31+血管，而在使用CXCR4拮抗劑治療的6只小鼠的腫瘤中，2只有局灶性瘤內或瘤周血管，與對照組小鼠相比沒有出現分布瘤內血管的腫瘤(圖8D-E)。
到這里文章的主要內容就介紹完了，文章使用組織及單細胞數據，生信分析及實驗驗證相結合，深度刻畫了PCa微環境中的TEC關鍵基因的功能來探索其影響腫瘤發展的潛在分子機制，并在復雜的PCa基質細胞相互作用中識別了潛在靶點。文章只重點關注了一個細胞類型，并深度研究了其關鍵基因的功能，條理清晰，層層遞進，有理有據，十分值得小伙伴們參考學習。
